Создание и исследование свойств новых генетических систем на основе элементов лактозного оперона Escherichia coli

• Автор: Скороходова, Александра Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 133 с. : ил.

1. Промоторы сайты инициации транскрипции

2. Примеры генетических систем с регулируемой инициацией транскрипции

2.1. Система регуляции транскрипции лакгозного опсрона Е.соН

2.2. Особенности регуляции транскрипции арабинозного оперона

2.3. Особенности взаимодействия репрессора бактериофага X с операторами

2.4. Использование механизмов регуляции транскрипции фага Т

3. Метаболически регулируемые системы экспрессии генов

3.1. Элементы регуляции транскрипцииюрегулона Е.соН

3.2. Элементы регуляции транскрипции генов гигсистемы МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы, плазмиды и среды Олигонуклеотиды

Проведение полимеразной цепной реакции Генноинженерные методики Р1зависимая трансдукция Электрофорез клеточных белков
Определение активности ргалактозидазы в экстрактах бактериальных клеток
Измерение люминесценции бактериальной культуры Электротрансформация клеток Е.соН
Проведение интеграции фрагментов ДНК в бактериальную хромосому, с использованием ЕссГзависимой системы рекомбинации бактериофага X
Конструирование штаммов .i v и Е.соН , используя метод зависимой интеграции фрагментов ДНК в бактериальную хромосому Конструирование рекомбинантных плазмид
Оценка числа копий вектора тоб по сравнению с Исследование эффективности мобилизации плазмид
Анализ стабильности наследования бактериальных плазмид в клетках Е.соН
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Создание и исследование свойств авто и плавно регулируемого генетического элемента ivI
1.1. Молекулярное клонирование регуляторного элемента ОзРасуузОс и структурной части гена Е.соН с высокоэффективным участком связывания рибосом
1.2. Создание искусственного генетического элемента v
1.3. Исследование свойств нового искусственного генетического элемента
1.3.1. Исследование свойств нового искусственного генетического элемента, с использованием xоперон i ii в качестве репортера
1.3.2. Исследование свойств нового искусственного генетического элемента, с использованием гена .i в качестве репортера
1.4. Практическое применение нового искусственного авторегулируемого генетического элемента i
2. Создание и исследование свойств новых оптимизированных вариантов гибридных 0ассодержащих элементов лактозного оперона
2.1. Создание новых оптимизированных вариантов гибридных 0дссодержащих промоторов
2.2. Исследование свойств новых оптимизированных вариантов гибридных Оiсодержащих промоторов
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ


Считается, что различие в эффективности транскрипции с конститутивных промоторов обусловлено лишь специфической структурой самих промоторов и особенностями их взаимодействия с РНКП. Однако отнесение конкретного промотора к группе конститутивных отражает лишь состояние его изученности на сегодняшний день и, естественно, может отражать неполноту наших знаний о внутриклеточных механизмах регуляции транскрипции. Можно было бы указать достаточно много примеров, когда открытие новых регуляторных факторов переводило бы промоторы, ранее считавшиеся конститутивными, в группу регулируемых. Кроме того, и для некоторых регулируемых промоторов неизвестны конкретные белковые регуляторы, но при этом хорошо установлено, что эффективность инициации транскрипции с них зависит, например, от скорости роста. Последнее, в частности, может быть связано с зависимостью пула свободной РНКП от скоростью роста и се перераспределением между различными клеточными промоторами в зависимости от ее сродства к промогору и концентрацией фермента. Поэтому строго говоря, отнесение промоторов к группе конститутивных имеет скорее отношение к экспериментам с ними i vi на модельных системах и их нечувствительности к известным факторам позитивной и негативной регуляции. Тем не менее, очень условно такие промоторы принято считать конститутивными и i viv, пока экспериментально не будет показана их регулируемость. В то же время хорошо известно, что такие условно конститутивные промоторы могут сильно отличаться по своей структуре, что, в конечном итоге, приведет к различиям в эффективности инициации транскрипции более чем на два порядка величины. Для конститутивных промоторов упрощнно процесс инициации транскрипции можно описать следующим образом. Сначала корфермент РНКП в комплексе с одной из асубъединиц обратимо связывается с промоторной последовательностью ДНК и образуется первичный транскрипциоино не активный, так называемый закрытый, комплекс. Затем происходит переход закрытого комплекса в открытый, что сопровождается расплетанием небольшой области ДНК вокруг стартовой точки. После образования нескольких абортивных коротких транскрнпгов РКП, уже без асубьединицы, покидает промотор, образуя устойчивый элонгационный комплекс рис. РНКП . В настоящее время, установлен субъединичный состав РНКП . РНКП с промоторной ДНК , 8, 4, 4, 4. В связи с этим, в данном разделе организация промоторных областей, узнаваемых РНКП, и влияние их структуры на эффективность инициации транскрипции будут рассмотрены без учета особенностей строенияфункционирования РНКП. Главный элемент промотора место специфического связывания РНКП, включающее участок инициации транскрипции. Длина соответствующего фрагмента ДНК составляет около п. Были предприняты попытки, определить характерные особенности ДНК, необходимые для специфического связывания РНКП , . Для этого сравнивали последовательности различных промоторов РНКП . РНКП не обнаружено протяженных консервативных последовательностей. ЯШ . Рнс. Модель коиформационных перестроек в молекуле РНКП Е. Н на стадиях инициации и элонгации транскрипции. Слева изображены а структура замкнутого кольца корфермента РНКП в растворе б размыкание кольца, которое происходит при присоединении осубъединицы и образование холофермента в связывание с промотором и образование закрытого промотороного комплекса г изомеризация в открытый промоторный комплекс д формирование элонгационного комплекса. Правая часть рисунка е, ж, з суммирует результаты футпринтингов соответствующих транскрипционных комплексов 0, 7. ДНКматрица изображена в виде цилиндра. Полностью защищенные РНКП участки ДНКматрицы обозначены тмным цветом указаны и консенсусные области и точка начала транскрипции 1 в прокариотическом промоторе. В составе прокариотического промотора обычно имеется два относительно консервативных участка длиной по 6 н. При сравнении этих областей в различных промоторах выведены канонические последовательности, которые содержат нуклеотиды наиболее часто встречающиеся в каждой позиции. Для участка это ТАТААТ блок Прибнова и для ТГСАСА. Следует отметить, что это касается промоторов Е. Н, узнаваемых РНКП в комплексе с о0.