Механизм автокаталитического нитрозилирования и нитрования аминокислот в составе белков с гидрофобными участками

• Автор: Рафиков, Руслан Робертович
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 86 с. : ил.

Оглавление
1. Введение

1.1. Актуальность исследования

1.2. Цель и задачи настоящего исследования

1.3. Научная новизна

1.4. Научнопрактическое значение

2. Обзор литераруры

2.1. Введение

2.2. Основные этапы изучения оксида азота

2.3. Синтез 0 в оганизме

2.3.1 0 синтазный путь

2.3.2 Несинтазный путь синтеза 0
2.4. Общие физикохимические характеристики 0
2.5 Активные метаболиты 0
2.6 Окисление кислородом
2.7 Окисление переходными металлами
2.8 Нитрозилирование белков
2.9 Образование пероксинитрита
2. Нитрование белков
2. Дснитрование нитротирозина
2. Выводы литературного обзора
3 Методики экспериментов
3.1 Приготовление раствора 0 в воде
3.2 Приготовление раствора пероксинитрита
3.3 Синтез защищенных по триптофану ,
3.4 Сперктоскопичсское определение продуктов нитрозилирования
3.5 Тонкослойная хроматография производных А
3.6 Определение нитрозотиолов
3.7 Определение нитрозотирозина методом Всстсрнблот анализа
3.8 Определение нитротирозина методом
3.9 Распределение нитротирозина в белках лизата
3. Приготовление первичной культуры гиппокампальных нейронов крыс.
3. Определение коэффицента распределения 0 .
4 Результаты и обсуждение
4.1 Эффект окружения в белке на реакцию нитрозилирования триптофана и цистеина под действием 0
4.2. Зависимость скорости нитрозилирования от концентрации 0
4.3 Использование в качестве зондов для определения 3 внутри гидрофобной фазы белка
4.4 Определение коэффициента распределения для 0 в системе альбуминвода
4.5 Катализ образования нитрозотиолов под действием насыщенного 0
4.6 Участие различных путей в переносе 0 из гидрофобной фазы.
4.7 Участие 0 в нитровании тирозиновых остатков в белках.
4.8 Различие в реакции нитрования тирозина между 0 и пероксинитритом
4.9 Участие тиолов в реакции нитрования тирозина.
4. Зависимоть уровня нитротирозина в клетках Е i от присутствия тиолов в питательных средах
4. Восстановления нитротирозина в культуре нейронов с помощью тиолов при различных нитрозилирующих стрессах
4. Корреляция между различными способами нитрования белков в клетках и выживаемостью клеток
4. Заключение
5 Выводы
6 Список литературы
Введение
Актуальность


В последнее время появились работы, в которых показано ускорение тримолекулярной реакции 0 с кислородом в гидрофобных фазах, присутствующих в организме, таких как липидные частицы, мембраны клеток . Недоспасов А. Благодаря своей гидрофобной природе кислород и 0 накапливаются в гидрофобных веществах, и реакция окисления 0 ускоряется за счет эффекта концентрирования, это явление получило название мицеллярный катализ. Весьма актуальной и неисследованной областью представляется участие белковых гидрофобных участков в мицеллярном катализе окисления . Многие ферменты, в регуляции которых участвует , не имеют металлических центров или показано, что не взаимодействует с металлическим центром. Поэтому в данных системах возникает вопрос о механизме действия 0 на такие белки. Наиболее распространенным и исследованным механизмом регуляции белков с помощью 0 является образование нитрозопроизводного цистеинового остатка нитрозоцистеина. Показано, например, что нитрозилирование цистсина в белке, ответственном за функционирование кальциевых каналов, влияет на выход кальция из скелетной мышцы . Однако, на главный вопрос каков механизм образования нитрозоцистеина, если 0 и цистсин не реагируют между собой непосредственно ответа до сих пор нет. Поэтому, интересной и совершенно неисследованной проблемой является связь между модифицированием с помощью аминокислот в составе белков и окислением 0 в гидрофобных участках белков. При окислении кислородом, конечным продуктом реакции является Из вещество, известное как сильнейший нитрозилирующий агент. Таким образом, белки, связанные с мембраной или имеющие, гидрофобные участки могут нитрозилировать свои собственные аминокислоты благодаря реакции окисления 0 в этих гидрофобных областях. Установлено, что низкомолекулярные нитрозотиолы, такие как нитрозоцистеин и нитрозоглутатион, могут играть в организме роль, схожую с . Они расслабляют сосуды, уменьшают свертываемость крови то есть действие этих соединений однонаправлено с действием 0. Однако, время жизни нитрозотиолов в физиологических средах на порядки длиннее, чем у 0 и, кроме того, у них отсутствует многие отрицательные свойства 0, такие как образование пероксинитрита и ингибирование ферментов с металлическими центрами. Механизм образования таких низкомолекулярных тиолов до сих пор дискутируется. 0. Хотя, на сегодняшний день существует лишь небольшое количество работ, посвященных модификации триптофана оксидом азота, эта область становится, в последнее время, очень привлекательна для исследователей. Известно, что нитрозотриптофан расслабляет гладкие мышцы и уменьшает агрегацию тромбоцитов, что говорит о его действии, похожем на действие 0. Механизм образования и распада нитрозотриптофана в физиологических условиях также совершенно не изучен. Огромной проблемой в области исследования 0 является понимание процессов образования и путей деградации такого метаболита 0, как нитротирозин. Известно, что нитротирозин является маркером многих патологических процессов в организме. Его накопление в клетках наблюдают в месте воспаления, при ишемииреперфузии и нейродегенеративных заболеваниях. Образование нитротирозина, в первую очередь, связывают с образованием пероксинитрита, который получается в реакции 0 с супероксид анионом. Нитротирозин является стабильным метаболитом и его накопление приводит к запуску программной гибели клетки апоптозу. Однако, поскольку и в здоровой ткани наблюдается небольшой уровень нитрогирозина, этот факт приводит к тому, что у многих исследователей возникает вопрос о механизме деградации нитротирозина. Сейчас большое количество публикаций посвящено поиску путей нсинзиматеческого восстановления нитротирозина Мигас К или поиску фермента денитразы ГзсЫгороЫоБ Н. Таким образом, актуальность и перспективность исследования механизмов модификации аминокислотных остатков под действием 0 в белках представляет интерес для широкого круга исследователей связанных с физиологией, биохимией и медициной.