Механизм формирования электронно-возбужденных состояний в бактериальной биолюминесценции

• Автор: Кудряшева, Надежда Степановна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Красноярск
• Количество страниц: 326 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ЭЛЕКТРОННОВОЗБУЖДЕННЫЕ СОСТОЯНИЯ В

БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ.

1.1. Ферментативные хемилюминесцентные реакции светящихся

организмов.
1.2. Механизмы формирования электронновозбужденных состояний хемилюминесцентной ферментативной реакции

1.2.1. Химические процессы, предшествующие стадии электронного

возбуждения

1.2.2. Взаимодействие субстратов с ферментами в надмолекулярных

структурах.
1.2.3. Стадия формирования электронновозбужденных состояний
1.3. Возможность заселения высших электронноколебательных состояний эмиттера
1.3.1. Закономерности внутримолекулярной миграции энергии
возбуждения в эмиттере.
1.3.2. Формирование электронновозбужденных состояний в
хемилюминесцентных процессах.
1.3.3. Заселение высших электронновозбужденных состояний
эмиттера в биолюминесцентном процессе
1.4. Эффективность элементарных физикохимических процессов в
биолюминесцентиой реакции
1.4.1. Механизмы переноса энергии электронного возбуждения в
люминесцентных системах. Природа донора и акцептора
1.4.2. Миграция электрона в биолюминесцентных системах
1.4.3. Миграция водорода Не Н в биолюминесцентиой системе .
1.5. Применение спектроскопии с временным разрешением для
изучения межмолекулярных взаимодействий.
1.6. Использование системы сопряженных ферментативных реакций
качестве люминесцентного биотеста.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО 1 ГЛАВЕ.
Глава 2. МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
2.1. Реактивы
2.2. Методы измерения.
2.2.1. Регистрация кинетики биолюминесценции.
2.2.2. Регистрация флуоресценции при стационарном возбуждении
2.2.3. Флуоресценция с временным разрешением.
2.2.4. Измерения оптической плотности растворов
2.3. Обработка данных.
2.3.1. Обработка данных биолюминесцентного анализа.
2.3.2. Флуоресценция при постоянном возбуждении
2.3.3. Спад флуоресценции и анизотропии флуоресценции
2.3.4. Расчет скоростей окисления НАДН.
2.4. Характеристики исследуемых экзогенных соединений
Глава 3. ИЗУЧЕНИЕ ЗАСЕЛЕННОСТИ ЭЛЕКТРОННО
ВОЗБУЖДЕННЫХ СОСТОЯНИЙ ЭМИТТЕРА.
3.1. Экспериментальное доказательство заселения высших
электронновозбужденных состояний эмиттера с
использованием экзогенных молекулярных акцепторов энергии 1
3.2. Изучение возможности резонансной миграции энергии в
системе эмиттер биолюминесценции гидрофобная молекула.
3.3. Дезактивация флуоресцентных состояний эмиттера Б в присутствии молекулярных акцепторов энергии.
3. 4. Внешний эффект тяжелого атома в биолюминесцентной системе.
Глава 4. СКОРОСТЬ ДЕЗАКТИВАЦИИ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ
СОСТОЯНИЙ ЭМИТТЕРА И ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ
СОЕДИНЕНИЙ НА ЭЛЕКТРОНУЮ ПЛОТНОСТЬ.
Глава 5. СКОРОСТЬ ДЕЗАКТИВАЦИИ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ
СОСТОЯНИЙ ЭМИТТЕРА И ВЛИЯНИЕ СОЕДИНЕНИЙ С РАЗЛИЧНЫМ РЕДОКСПОТЕНЦИАЛОМ НА ПЕРЕНОС ВОДОРОДА И с Н
5 Влияние рсдоксактивных соединений на систему сопряженных
реакций, катализируемых НАДФНФМНоксидоредуктазой и люциферазой
5.2. Кинетические и термодинамические характеристики реакций
окисления НАДН экзогенными соединениями
5.3. Действие органических окислителей на процессы миграции водорода в полиферментных биолюминесцентных системах
5.4 Присутствие экзогенного низкомолекулярного окислителя в
биолюминесцентной системе
Глава 6. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ЭКЗОГЕННЫХ СОЕДИНЕНИЙ С ФЕРМЕНТАМИ МЕТОДАМИ СПЕКТРОСКОПИИ С ВРЕМЕННЫМ РАЗРЕШЕНИЕМ
6.1. Взаимодействие с ферментами ксантеновых красителей,
включающих атомы галоидов разной массы.
6.2. Взаимодействие нефлуорссцентных окислителей с ферментами.
6.3. Взаимодействия ферментов из набора люминесцентных
биотестов с экзогенными флуоресцентными соединениями
Глава 7. ПРИМЕНЕНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ВОЗДЕЙСТВИЯ НА БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЮ ЭКЗОГЕННЫХ СОЕДИНЕНИЙ ДЛЯ ЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО ТЕСТИРОВАНИЯ
у Действие солей металлов на биолюминесцентные системы
различной сложности.
у Действие редоксактивиых соединений на биолюминесцентные
системы различной сложности
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


При взаимодействии с белками гидрофобная часть флавина А либо контактирует со средой, либо связывается путем гидрофобных взаимодействий с протеином , . Из опытов по определению константы диссоциации и люминесцентной активности различных флавинов с бактериальной люциферазой i , i, следует, что для связывания и проявления люминесцентной активности большое значение имеет как структура изоалоксазинового кольца, так и отрицательно заряженная боковая цепь флавинов. Для ряда бактериальных люцифераз Viii, Vii vi, i установлены отношения между скоростью спада интенсивности биолюминесценции и окислительным потенциалом связанного с ферментом 4агидроксифлавина. Замещения в изоаллоксазиновом кольце влияют на скорость реакции интермедиатов с кислородом и альдегидом. Полученные результаты подтвердили, что электроннодонорная способность интермедиата II Схема. В результате проведенных исследований установлено, что спад люминесценции происходит быстрее с аналогами ФМН, у которых редокс потенциал меньше. Этот результат показывает, что на этапе, лимитирующем скорость биолюминссцснтной реакции, электронная плотность уменьшается. Заместитель в изоаллоксазиновом кольце флавина, который является донором электронной плотности, способствует этому процессу. Люциферазы из разных видов светящихся бактерий имеют сходное сродство к ФМН Н2, что выражается в близости значений кинетических констант Михаэлиса и констант диссоциации ферментсубстратного комплекса. Константы связывания люциферазы с продуктом реакции ФМН, на тричетыре порядка меньше, чем с ФМНН2 Гительзон и др. И как показано в ряде работ . ФМН Н2 не доступен для внешнего воздействия. В биолюминесцентных системах i vi эффективным источником ФМНН2 для хемилюминесцентной реакции служит окислитслыювосстановительная реакция, катализируемая НАДФНФМНоксидоредуктазой . Физиологические функции НЛДФНФМНоксидоредуктаз до сих пор четко не определены. Есть предположение, что они не имеют специфических функций, а скорее служат как общий источник электронов ivi , . Восстановленный флавин является существенным для различных биологических процессов, таких как метаболизм железа, метаболизм кислорода, репликация ДНК, биолюминесценция и др. Ленинджер, v, , , . Флавинредуктазы определены во всех светящихся бактериях и, как считается, обеспечивают люциферазу восстановленным флавииом в качестве субстрата люминесцентной реакции i, . Участие НАДФНФМНоксидоредуктаз в люминесцентных процессах i viv до сих пор вызывает большие сомнения, так как для этого фермента не выполняется главный принцип, определяющий принадлежность белка к люминесцентной системе его содержание в бактериях не зависит от содержания люциферазы и интенсивности люминесценции Гительзон и др. Принято считать , , что флавинредуктазы могут быть идентифицированы как редуктазы 1 специфичные к НАДФН, 2 специфичные к НАДН, 3 специфичные как к НАДФН, так и к НАДН со схожей эффективностью. Флавинредуктазы могут быть так же разделены на два класса на основе содержания простетической группы. Так например, НАДН. НЛДФНФМНоксидоредуктазы в Vi vi и Vi ii имеют нековалентно связанный флавиновый кофактор , , , . Флавинредуктазы в светящихся бактериях также различаются сродством к ФМН, ФМН Н2, кинетическим механизмом и предполагаемыми взаимодействиями с люциферазой. Так, в ряде работ показано, что в Вепескеа vi присутствуют две флавинредуктазы, специфичные к НАДН и к НАДФН ii . Показано, что НАДНФМНоксидоредуктаза специфична к ФМН и ФАД, в то время как НАДФНФМН оксидоредуктаза использует разнообразные электронные акцепторы i . При изучении характеристик НАДН и НАДФН. НАДНФМНоксидоредуктаза показывает последовательный механизм реакции, го есть образует тройной комплекс с субстратами реакции, при этом связывает ФМН преимущественно через гидрофобную часть изоаллоксазинового кольца. НАДН, функционирует по пингпонг механизму. НАДФНФМНоксидоредуктаза, которая имеет сродство как к НАДН, так и к НАДФН. Установлено, что данный фермент имеет флавиновый кофактор , i, и функционирует по пингпонг механизму . Хотя по результатам, представленным Мажульем Мажуль и Данилов, , фермент имеет упорядоченный механизм присоединения субстратов.