Анализ белок-белковых взаимодействий в живой клетке методом флюоресцентного резонансного переноса энергии : Механизмы транспорта токсинов АВ5 структуры

• Автор: Мажуль, Ирина Вячеславовна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 62 с. : ил.; 20х14 см

Состояние, при котором перенос энергии возможен км, отражает состояние взаимодействия двух исследуемых белков, меченых соответственно двумя Хромофорами донором и акцептором. Мы применили этот метод в сочетании с высокоразрепавхцей Многофотонкой Многофокальной Микроскопией , или МММ сокращнный термин. В качестве модельной системы был использован разработанный нами ранее ретроградный транспорт субъединиц холерного токсина ХТ, i и др. Предложенные до отого системы внутриклеточного везикулярного транспорта были достаточно сложны, трудно воспроизводимы, вызывали побочные неконтролируемые аффекты например, необходимость дополнительной обработки клеток ДТТ для внутриклеточного высвобождения связанного с носителем белка i и др. Вышеизложенная ситуация объясняет актуальность проблемы создания и разработки простой модели, позволяющей изучать механизмы клеточного транспорта а также системы регистрации , позволяющей изучать функции отдельных белков, участвующих в формировании, распознавании и слиянии донорных везикул с акцепторной мембраной в условиях живой клетки. С помощью предложенных ранее моделей можно было экспрессировать в клетке лияь один из транспортируемых белков например, вирус везикулярного стоматита VV , . Е. и др. Гольджи и эндоплаэматическим ретикулумом ЭР. В последнем случае разделение антероградиых везикул, направленных от ЭР к аппарату Гольджи от ретроградных везикул, идущих в противоположном направлении, оказывалось технически невозможным. Согласно современным представлениям формирование транспортной везикулы на мембране донорного компартмента инициируется взаимодействием белков, переносимых этой везикулой с трансмеыбраккым рецептором. При этом изменение структурного состояния связанного рецептора может распознаваться цитоплазматическими белками, которые ассоциируются с мембраной и инициируют образование транспортной везикулы. Однако надежного метода, позволяющего регистрировать формирование таких функциональноактивных белковых комплексов в живой клетке разработано не было. Таким отразом, предлагаемая работа описывает специально разработанную для мониторинга везикулярного транспорта модельную систему субъединиц холерного токсина и исследование этой системы с помощью разработанного автором и международно признанного метода Флюоресцентного Резонансного Переноса Энергии ФРПЭ. Для этого ряд белков, участвующих в ретроградном транспорте X, экспрессировали п живой клетке как доноракцепторные пары с использованием живых хромофоров, синего и желтого СРР и мутантов зелного флюоресцирующего белка. Внутриклеточные функции этих белков были исследованы в живой клетке вышеуказанным методом ФРПЭ МММ и др. Разработка и успешное применение такого метода открыло принципиальные возможности для исследования и мониторинга многочисленных белковых комплексов а также РНК, ДНК белковых. Таким образом становится понятньм, что применение метода ФРЭТМММ в сочетании с другими развиваюсвимися новыми методами как напр. Флюоресцентная Корреляционная Спектроскопия и т. Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в разработке метода, основанного на резонансном переносе энергии, позволяющего изучать белокбелковые взаимодействия в живой клетке. Разработать точный метод регистрации белокбелковых взаимодействий в живой клетке, основанный на физическом явлении флюоресцентного резонансного переноса энергии между донором и акцептором при возбуждении донора ФРПЭ. Состякие при котором перенос энергии возможен нм отражает взаимодействие двух исследуемых белков, меченых соответственно двумя хромофорами донором и акцептором. Разработанная система внутриклеточного транспорта ХТ в сочетании с экспрессией в одной и той же клетке живых хромофоров СРР и УРР создала предпосылки для изучения взаимодействий белков, индуцированных транспортом ХТ. Создать спектроскопически подходящие для ФРПЭ фяюоресцет ше химерные пары химерных белков. В данной работе были использованы доноракцепторные пары с интегральным перекрытием спектров синий СРР и желтый УРР мутанты зелного флюоресцирующего белка СРР, образующие доноракцепторную пару.