Исследование структуры и функций Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума методом люминесценции и ЭПР

• Автор: Котельникова, Раиса Алексеевна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 136 c. : ил

Выяснение механизма действия физиологическиактивных соединений на мембрану СР с помощью физических методов люминесценции и ЭПР. Предлагаемая диссертационная работа состоит из пяти глав. Первая глава посвящена анализу современных сведений о строении и механизме действия Са2АТФазы, полученных физическим методами люминесценции и ЭПР. Во второй главе приводится описание методик, применяемых для решения поставленных задач. В третьей главе с помощью триплетных зондов определяется локализация каталитическиактивного центра Са2АТФазы относительно липидного бислоя мембраны СР и расположение центров свя
зывания Са и Па относительно АТФ. Четвертая глава посвящена определению квантового выхода флуоресценции и пространственного расположения триптофановых

остатков Сас АТФазы, их участия в формировании активного цент

ра фермента и Са транспортирующего канала. Эта задача решалась с помощью комбинации методов люминесценции, спектрофотометрии и химической модификации триптофановых остатков. В пятой главе определяется механизм действия четырех групп важных биологическиактивных соединений на мембрану СР и Са2АТФазу. На основании полученных данных предлагается структурная модель Са2АТФазы и анализируется изменение конформации фермента в момент образования ферментсубстратного комплекса. Исходя из данных о структуре фермента, полученных в диссертации, установлен механизм действия биологическиактивных соединений на мембрану СР и Са2АТФазу. Выполнение диссертационной работы проводилось в Отделении Института химической физики АН СССР, Черноголовка, в лаборатории кинетики ферментативного катализа. Транспортная Са2АТФаза СР К. Ф.З. СР, осуществляющим активный транспорт ионов Са против градиента концентрации. В настоящее время установлено, что Са2ЛТФаза представляет собой мембранный интегральный белок, состоящий из одной полипелтидной цепи с молекулярной массой 5 ООО . Две трети объема этого белка находятся в водной фазе и около одной трети локализовано в гидрофобной зоне мембраны. На долю аминокислот, расположенных в гидрофобной фазе мембраны, приходится из триптофановых остатков, включенных в полипептидную цепь белка. Функциональная активность фермента
Сас АТФазы проявляется лишь в составе мембран, при этом в мембране СР содержание липидов составляет 0,5 мг на I мг белка . Было показано, что ионы Сат активируют реакцию гидролиза АТФ, при этом в результате гидролиза одной молекулы АТФ осуществляется транспорт двух ионов Са2 6. Связывание АТФс ферментом прожюсодит в составе комплекса с ионами Мд. Ми заменяющими Мд 3, причем, связывание комплекса МЙТФ происходит независимо ота2. Это означает, что существуют два центра связывания для Мд и для Са2. Помимо основного каталитического центра связывания АТФ, СаАТФаза содержит второй центр связывания субстрата с меньшим ,
сродством, который, возможно, является не каталитическиактивным, а аллостерическим . В состав каталитическиактивного центра Са2АТФазы включены также группы и МН2 группа . Блокирование этих групп приводит к потере ферментативной активности. Связывание Са2 с АТФазой в присутствии МдАТФ приводит к фосфорелированию фермента по карбоксильной группе аспарагиновой кислоты. Данная реакция является обратимой. Обнаружено, что в нефосфорелированном состоянии Са2связывающие центры фермента
доступны для ионов Сат с внешней стороны мембраны СР и недоступны с внутренней. При фосфорелировании Са2связывакнцие центры становятся доступными с внутренней стороны и недоступными с
внешней и константа связывания Сат в этом случае снижается на три порядка ,. Ионы Мд. МдАТФ могут взаимодействовать с белком самостоятельно. Высказывается предположение, что они координируются центрами слабого связывания Са2, вытесняя при этом ионы Са2 в раствор 6. Макромолекулы Са АТФазы, включенные в липидный бислой, могут агрегировать, образуя олигомерные структуры. В настоящее время существуют две модели структурной организации Са2АТФазы СР. Согласно первой , транспорт Са2 осуществляется белковым комплексом, который пронизывает мембрану и создает в ней заполненный водой канал на границе контакта субъединиц.