Изучение домена олигомеризации малого белка теплового шока с молекулярной массой 16,3 КДА с помощью методов спектроскопии электронного парамагнитного резонанса

• Автор: Парфёнова, Мария Александровна
• Шифр специальности: 03.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 105 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК РИСУНКОВ.

СПИСОК ТАБЛИЦ

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы

Цель исследования

Задачи исследования

Научная новизна работы.

Практическая значимость работы.

Публикации.

Апробация работы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Проблема туберкулеза и необходимость новых форм терапии
1.2. Патогенез туберкулеза как основа проблемы латентной формы болезни
1.3. Роль мБТШ ,3 в жизнеспособности бациллы в латентной фазе.
1 А. Локализация и функции мБТШ ,3
1.5. Структура мБТШ ,3
1.6. Принадлежность мБТШ ,3 к семейству малых белков теплового шока и
общие характеристики этого семейства
1.7. Олигомеризация как основа шаперонной функции малых белков теплового
1.8. Важность изучения домена олигомеризации мБТШ ,3
1.9. Выбор метода изучения домена олигомеризации мБТШ ,3
1 Рентгеновский структурный анализ.
1 Спектроскопия ядерного магнитного резонанса ЯМР
1 Преимущества метода ЭПРспектроскопни
1 Развитие метода сканирования белков меткой свободного радикала.
1 Эффективность метода сканирования нитроксильиой меткой и ЭПР
спектроскопии для изучения малых белков теплового шока
1 Основы метода сканирования белков меткой свободного радикала.
1 Итог обзора литературы.
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Реактивы.
2.2. Идентификация домена олигомеризации мБТШ ,3
2.3. Клонирование гена мБТШ ,3
2.4. Направленный мутагенез.
2.5. Производство и очистка белка.
2.6. Присоединение метки свободного радикала к белку
2.7. ЭПР спектроскопия
2.7.1. Регистрация спектров.
2.7.2. Обработка спектров.
2.7.3. Анализ вращательной мобильности метки
2.7.4. Регистрация феномена насыщения амплитуды ЭПР сигнала.
2.7.5. Оценка степени доступности метки ЫЮА
2.7.6. Определение локализации метки в субъединицах мБТШ ,3.
2.7.7. Формирование смешанных олигомеров
2.7.8. Определение числа взаимодействующих доменов олигомеризации в мБТШ
2.8. Гельхроматография.
2.9. Определение шаперонной активности
2 Библиографический поиск
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Идентификация домена олигомеризации мБТШ ,3
3.2. Производство белка.
3.3. Очистка белка
3.4. Определение структуры домена олигомеризации мБТШ ,3
3.4.1. ЭПР спектры меченых мутантных белков.
3.4.2. Анализ вращательной мобильности метки
3.4.3. Определение степени доступности метки к ЬПЕОЭА.
3.4.4. Сравнение результатов анализа мобильности и доступности метки к МЕЭОА
3.5. Молекулярное моделирование домена олигомеризации мБТШ ,3.
3.6. Определение положения домена олигомеризации в мБТШ ,3
3.6.1. Титрование белка Б гидрохлоридом гуанидина.
3.6.2. Определение числа взаимодействующих доменов олигомеризации.
3.7. Модель четвертичной структуры мБТШ ,3 и пространственного
положения домена олигомеризации
3.8. Изучение последствий замены аминокислотных остатков в домене
олигомеризации белка теплового шока на процессы олигомеризации.
3.9. Изучение последствий замены аминокислотных остатков в домене олигомеризации белка теплового шока на шапероииую функцию белка
3 Заключение.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
БИБЛИОГРАФИЯ


СПИСОК РИСУНКОВ. ВВЕДЕНИЕ. Научная новизна работы. Практическая значимость работы. Публикации. Апробация работы. ГЛАВА 1. Роль мБТШ ,3 в жизнеспособности бациллы в латентной фазе. Рентгеновский структурный анализ. Развитие метода сканирования белков меткой свободного радикала. Основы метода сканирования белков меткой свободного радикала. Итог обзора литературы. Реактивы. Направленный мутагенез. Производство и очистка белка. Регистрация спектров. Обработка спектров. Регистрация феномена насыщения амплитуды ЭПР сигнала. Определение локализации метки в субъединицах мБТШ ,3. Гельхроматография. ГЛАВА 3. Производство белка. ЭПР спектры меченых мутантных белков. Определение степени доступности метки к ЬПЕОЭА. Молекулярное моделирование домена олигомеризации мБТШ ,3. Титрование белка Б гидрохлоридом гуанидина. Определение числа взаимодействующих доменов олигомеризации. Заключение. ВЫВОДЫ. БИБЛИОГРАФИЯ. Рисунок 1. . Рисунок 2. Структуры мБТШ ,5 i ii i . Л и мБТШ ,9 растения ржи v . Рисунок 3. Рисунок 4. Рисунок 5. Рисунок 6. Пример зависимости амплитуды центральной линии ЭПР сигнала меченого белка от мощности магнитного поля, в отсутствии и при добавлении веществ, влияющих на скорость процесса релаксации. Рисунок 7. Варианты расположения свободнорадикальной метки в белке. Рисунок 8. Рисунок 9. Рисунок . Рисунок . Рисунок . Рисунок . ЭПР спектр белка СШ. Рисунок . ЭПР спектр белка . Рисунок . Рисунок . Рисунок . Рисунок . Рисунок . ЭПР спектр белка VIЯ1. Рисунок . ЭПР спектр белка БОЗЯ. Рисунок . Рисунок . Рисунок . ЭПР спектр белка Р5Я1. Рисунок . БТШ ,3. Рисунок . Насыщение ЭПР сигнала белка РЯ1. Рисунок . Рисунок . Рисунок . Рисунок . Рисунок . Рисунок . Насыщение ЭПР сигнала белка УШ. Рисунок . Насыщение ЭПР сигнала белка Т 1. Рисунок . Рисунок . Насыщение ЭПР сигнала белка Б1. Рисунок . Насыщение ЭПР сигнала белка ЫШ. Рисунок . Рисунок . Рисунок . ЕА. Рисунок . Рисунок . ЭПР спектр белка БЮЗИЛ в отсутствии гидрохлорида гуанидина. Рисунок . Рисунок . Рисунок . Рисунок . Рисунок .