Катализируемый пенициллинацилазой синтез β-лактамных антибиотиков в высококонцентрированных водных системах

• Автор: Буханов, Александр Леонидович
• Шифр специальности: 02.00.15, 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 125 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Псинцнллинацилаза из Е.со1 чччч.ч.ччччччч.ччч.ччччч.ччччч.чч.чччччч.ч.чч.ччч.ччччч.ччч

1.1.1 Общие свойства.

1.1.2 Структура активного центра пенициллинацилазы.

1.1.3 Механизм действия.

1.2 Ферментативный синтез рлактамных антибиотиков.

1.2.1 Основные подходы .

1.2.1.1 Термодинамически контролируемый синтез рлаюгамных антибиотиков.

1.2.1.2 Кинетически контролируемый синтез рлактамных антибиотиков

1.2.2 Кинетические закономерности катализируемого ПА переноса ацильной группы на нуклеофил .
1.2.3 Ферментативный синтез Рлактамных антибиотиков в гомогенных и гетерогенных растворосадок реагентов водных системах.
1.3 Факторы оптимизация синтеза рлакгамных антибиотиков .
1.3.1 Эволюция кинетической схемы фсрмсгтативного синтеза рлактамных аггибнотиков
1.3.2 Влияние ионной силы на ферментативный синтез рлактамных антибиотиков.
1.3.3 рНзавнсимость эффективности биокаталитичсских процессов, катализируемых ПА.
1.3.4 Влияние органических веществ на процессы биокаталитического получения рлактамных антибиотиков.
ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2.1 Материалы в
2.2 Методы ММН1МНММИ1МММ1МИ1МИМММИт1МНМММ1ММММНМММНМММ1ММНММНММ
2.2.1 Определение конста1гт специфичности кКк гидролиза антибиотиков и доноров ацильной
2.2.2 Количественная характеристика связывания нуклеофила в активном центре ПА
2.2.3 Кол1Р1Сственная характеристика связывания нуклеофила с ферментсубстратным комплексом
2.2.4 Анализ влияния добавленного нуклеофила на реакцию гидролиза ампициллина.
2.2.5 Изучение растворимости компонентов реакции
2.2.6 Создание кинетически пересыщенных водных систем в реакциях ферментативного синтеза Рлактамных антибиотиков.
2.2.7 Определение параметров нуклеофилыюсти бАПК в реакции синтеза ампициллина.
2.2.8 Изучение иуклеофильностн 6АПК в реакции синтеза ампициллина в присутствии неорганических солей
2.2.9 Изучение реакций ферментативного синтеза ампициллина, амоксициллина и цефалексина в высококонцентрированных водных системах с использованием эффекта кинетического пересыщения
2.2. Анализ состава реакционной смеси методом высокоэффективной жидкостной хроматографии .
2.2. Математическая обработка результатов и моделирование реакций.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Э.1 Анализ факторов, определяющих эффективность катализируемого ПА синтеза рлактамных антибиотиков
3.2 Кинетический анализ катализируемого ПА переноса ацильной группы на нуклеофил
3.2.1 Оптимизация кинетической схемы катализируемого ПЛ переноса ацильной группы на нуклеофил.
3.2.2 Изучение влияния добавленного нуклеофила на ферментативную реакцию.
3.3 Оптимизация катализируемого ПА переноса ацильной группы на нуклеофил в высококонцентрированных водных системах
3.3.1 Эффект кинетического пересыщения.
3.3.2 Определение параметров нуклеофильности 6АПК в высококонцентрированных водных системах
3.3.3 Влияние анионов неорганических солей на нуклеофильностъ 6АПК
3.3.4 Изучение зависимости нуклеофильности 6АПК от концентрации анионов.
3.3.5 Влияние неорганических солей на скорости синтеза и гидролиза при катализируемом ПА переносе ацнлыюй группы набАПК
3.3.6 Связывание аниона вблизи активного центра ПА.
3.3.7 Изучение влияния природы аниона на нуклсофильность 6АПК.
3.3.8 Разработка и применение модели ферментативного синтеза рлактамных антибиотиков
3.4 Катализируемый ПА синтез Рлактамных антибиотиков в высококониентрированных водных систсмах
3.4.1 Катализируемый ПА синтез ампициллина, цефалексина и а.моксициллина с использованием эффекта кинетического пересыщения.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


Наряду с полусинтетическим методом в последнее время наблюдается вс возрастающий интерес к разработке полностью биокаталитических методов получения лактамных антибиотиков, в которых ПА катализирует ферментативный перенос ацильной группы активированного донора в роли которых выступают эфиры и амиды карбоновых кислот на ядра антибиотиков 6АПК, 7АДЦК в водной среде. В связи с этим, особую актуальность приобретает задача изучения общих закономерностей катализируемых ПА биокаталитических превращений с переносом ацильной группы, понимание которых позволило бы разработать эффективные методы оптимизации технологических процессов. АПК разработка общих алгоритмов оптимизации процесса ферментативного синтеза рлактамных антибиотиков и выбор оптимальных условий синтеза ампициллина, цефалексина и амоксициллина, катализируемого пенициллинацилазой. Научная новизна работы. Практическая значимость работы. Полученные результаты позволили разработать научно обоснованные подходы для оптимизации ферментативного синтеза рлактамных антибиотиков. Предложенные методики позволяют проводить ферментативный синтез Рлактамных антибиотиков с выходами, превышающими значения, представленные в научной или патентной литературе, и могут быть рекомендованы для применения в технологических процессах биокаталитического получения ампициллина, цефалексина и амоксициллина. Пенициллинацилаза из . Пенициллинацилаза относится к классу гидролаз, подклассу амидогидролаз КФ 3. В настоящее время установлено 1, 2, 3, что пенициллинацилаза имеет гетеродимерную структуру и состоит из двух субъединиц а и рсубъедипицы различной молекулярной массы 0 и 0 , соответственно. Данные по исследованию субъединичного состава родственных пенициллинацилаз из v ii 4, 5. ПА из ii i является одним из первых ферментов, для которых первичная структура была определена методом секвенирования гена 3. Пенициллинацилаза относится к немногочисленной группе белков, субъединицы которых формируются из общего полипептидапредшественника в процессе посттрансляционного созревания. Механизм процессинга пснициллинацилазы включает в себя несколько стадий 8, 9. Предшественник синтезируется как полипептид , состоящий из сигнального пептида, содержащего аминокислот а. После устранения сигнального пептида предшественник проходит через цитоплазматическую мембрану в периплазматическое пространство, где в ходе последовательности специфических расщеплений предшественника образуются а и рсубъсдиницы
8, 9. При этом асубъедииица сворачивается первой и служит матрицей для сворачивания субъединицы . Опубликованные в году данные по рентгеноструктурному анализу РСА ПА из ii, а также комплексов фермента с ФУК, фенилметилсульфонил фторидом и другими ингибиторами позволили сформировать основные представления о структуре данного фермента. Согласно полученным данным, фермент имеет форму почки с глубокой чашеобразной выемкой в центре. Гетеродимер пенициллинацилазы состоит из двух тесно переплетенных цепей без очевидных дискретных областей. Усредненные размеры гетеродимера составляют xx А. Из анализа структуры комплекса фермента с ФУК Рис. Фенильная часть ингибитора направлена внутрь этого кармана, а карбоксильная группа взаимодействует с серином . Предполагается, что нуклеофильность гидроксильной группы концевого серина увеличивается за счет взаимодействия с собственной ааминогруппой при участии молекулы воды . Рис. Структура активного центра пенициллинацилазы со связанной в нем молекулой фснилуксусной кислоты но данным группы молекулярного моделирования отдела биокинетики НИИ ФХБ. Специфичность фермента к фенилацетильной группе объясняется комплементарностью фенилацетильного остатка и участка связывания ацильной группы субстрата активного центра фермента. При связывании субстрата в активном центре ПА между фенильными кольцами фенилуксусной кислоты и фенилаланина рРЬе возникают гидрофобные взаимодействия. Другой фенилаланин рРйс6 локализован на противоположной стороне гидрофобного кармана. Он образует гидрофобные взаимодействия с фенилуксусной кислотой, а также закрывает гидрофобный карман от растворителя. Третий фенилаланин, рРЬе, находился на дне гидрофобного кармана.