Кинетические закономерности ферментативного синтеза ампициллина, катализируемого пенициллинацилазой, в гомогенных, гетерогенных и твердофазных системах

• Автор: Юшко, Максим Ильич
• Шифр специальности: 02.00.15, 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 128 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ .

1 ОЬЗОР 4 ИТЕРАТ

1.1. ЕИ1XИАЦНЛ ЛЗА ИЗ II I

. . I. Общие свойства

1.1.2. Структура активного центра и механизм действия.

1.1.3. Субстхиппая специфичность и область

применения пеиицизяинспщлазы.

1.2. Ферментативный синтез рллктдмиых антибиотиков.

1.2.1. Общие закономерности синтеза

1.2.2. Методы оптимизации биокапшитического получения лактамных антибиотиков.

1.2.3. Кинетические закономерности и перспективы кгзвития.

1.3. ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ РЕАКЦИИ В ГЕТЕРОГЕННЫХ И ТВЕРДОФАЗНЫХ СИСТЕМАХ
1.3.1. Структура и каталитические свойства ферментов
в системах с минимальным содержанием воды
1.3.2. Особенности пюведения ферментативных реакций
в гетерогенных и твердозкгзных системах.
ПОСТАНОВКА ЧАДАМИ
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ .
2.1. Материалы
2.2. Методы
2.2.1. Титювание активных центров ПА
2.2.2. Определение актнвшкти пеншрь иинаци. шзы
2.2.3. Изучение стабильности нативной и иммобилизован ной пенициллинацилазы в условиях гетерогенных и твердофазных реакций.
2.2.4. Изучение стабилизации нативной и иммобилизованной
пенициллинацияазы в твердофазных системах б присутствии кристаллогидратов неорганических солей.
2.2.5.Изучение растворимости компонентой эеакции
при синтезе ампициллина.
2.2.6. Определение кинетических параметров реакции ферментативного синтеза ампициллина
2.2.7. Определение нукяеофилъпости 6АПК в реакции синтеза ампициллина.
2.2.8. Исследование влияния уходяцен группы донора ацильной
части на нуклеофильность 6Л ПК.
2.2.9. Изучение реакции ферментативного синтеза ампициллина в гомогенных системах
2.2 Изучение реакции ферментативного синтеза ампициллина
в гетерогенных системах.
2.2. И. Изучение реакции ферментативного синтеза ампициллина в твенкхразных системах.
2.2 Анапа состава реакционной смеси методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
2.2 Математическая обработка результатов и моделирование реакций
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
3.1. Изучение нуклеофильносги 6АПК в реакции ферментативного
СИНТЕЗА АМПИЦИЛЛИНА
3.1.1. Установление механизма переноса ацильной группы на нуклеофил.
катализируемого ПА
3. .2. Кинетические параметры доноров ацильной части. Зависимость
нукчеофильиости 6АПК от природы донора.
3.1.3. Изучение зависимости нукяеофияъности 6АПК
3.2. Изучение реакции ферменгативного синтеза ампициллина в
ГЕТЕРОГЕННЫХ И ТВЕРДОФАЗНЫХ СИСТЕМАХ.
3.2. .Особенностиреакции синтеза ампициллина, катализируемой пенициляинацимпой, в условиях гетерогенных систем
водаосадок реагентов
3.2.2. Стабильность и каталитические свойства ПА в системах
с низким содержанием воы.
3.2.3. Особенности ферментативного синтеза ампициллина в условиях твердофазных систем.
3.3. Анализ кинетической модели ферментативного переноса ацильной
ГРУППЫ НА НУКЛЕОФИЛ.
3.3.1. Зависимость максимального выхода целевого продукта от кинетических параметюв реакции.
3.3.2. Разработка кинетической модели ферментативного синтеза ампициллина в различных режимих протекания зеакции.
3.4. Оптимизация процесса ферментативного синтеза ампициллина,
КАТАЛИЗИРУЕМОГО ПЕНИЦИЛЛИНАЦИЛАЗОЙ .
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУ


Научная новизна работы В результате проведенных исследований впервые было показано, что реакция ферментативного синтеза ампициллина протекает через стадию образования ацилферментнуклеофильного комплекса установлено, что природа уходящей группы субстрата не влияет на соотношение начальных скоростей синтеза и гидролиза при проведении реакции ферметггативного синтеза ампициллина найдены экспериментальные значения параметров, определяющих эффективность ферментативного переноса ацильной группы на 6АПК изучена рНзависимостъ нуклсофильности 6АПК в реакции ферментативного синтеза ампициллина, предложены кинетические механизмы протекания реакции, позволяющие с хорошей точностью описать экспериментальные данные, а также сделать обоснованные предположения о причинах зависимости нуклсофильности 6АПК от значения реакционной среды предложена математическая модель, позволяющая описать протекание реакции биокаталитического получения рлактамных антибиотиков в гомогенных и гетерогенных системах показана способность нативной и иммобилизованной иенициллинацилазы проявлять каталитическую активност ь в системах с низким содержанием воды, вплоть до твердофазных смесей разработан метод стабилизации препаратов фермента в системах с низким содержанием воды при помощи кристаллогидратов неорганических солей разработаны общие подходы для проведения оптимизации ферментативного синтеза рлактамных антибиотиков. Практическая значимость работы. Полученные результаты позволили разработать научно обоснованные подходы дя оптимизации ферментативного синтеза антибиотиков пенициллинового ряда. Предложенные методики позволяют проводить ферментативный синтез ампициллина с выходами, превышающими имеющиеся до сих пор в научной или патентной литературе, и могут быть рекомендованы дя применения в технологическом процессе биокаталитического получения ампициллина. Пенициллинацилаза относится к классу гидролаз, подклассу амидогидролаз КФ 3. В настоящее время установлено 1, 2. Данные по исследованию субъединнчного состава родственных пенициллинацилаз из iv ii 4. Пенициллинацилаза относится к немногочисленной группе белков, субъединицы которых формируются из общего полипсптидапрсдшсствснника в процессе посттрансляционного созревания. Механизм процессинга пенициллинацилазы включает в себя несколько стадий 8, 9. Вначате синтезируется предшественник полипептид молекулярной массы кПа. Рсубъединица. Сигнальный пептид служит для переноса через цитоплазматическую мембрану, после чего он отщепляется и происходит расщепление предшественника на а и Рсубъединицы. Рсубъединице. Опубликование в I5 году данных по рентгеноструктурному анализу нснициллинацилазы из . Структуре и механизме каталитического действия данного фермента. Согласно полученным данным, фермент имеет форму почки с глубокой чашеобразной выемкой в центре Рис. Гетеродимер пенициллинацилазы состоит из двух тесно переплетенных цепей без очевидных дискретных областей. Усредненные размеры гстсродимсра составляют xx А. Из анализа структуры комплекса фермента с фенилуксусной кислотой, являющейся сильным конкурентным ингибитором, следует, что связывание субстрата происходит внутри глубокой выемки в поверхности белковой глобулы, на дне которой находится гидрофобный карман, образованный многочислешплми ароматическими структурами и боковыми цепями аминокислот. Фснильная часть ингибитора направлена внутрь этого кармана, а карбоксильная группа взаимодействует с серином В1. Предполагается, что нуклеофильность гидроксильной группы коицевого ссрина В1 увеличивается за счет взаимодействия с собственной ааминогруппой при участии молекулы воды. На Рис. Подобный способ активации, как недавно было установлено, встречается и в других амидогидролазах, объединенных по этому признаку в особый класс ферментов, ii i гидролаз. Рис. Общий вид гетеродимера пенщиляинацилазы из . РСА . Темным цветом представлена асубьедшшца, светлым субъединица фермента. СГВ
X
X
о
8огВ
Ни, н

V . X4
Рис. Механизм каталитического действия пенищшинацилазы по данный работы .