Принципы конструирования биокаталитических систем на основе полиэлектролитов в среде органических растворителей

• Автор: Гладилин, Александр Кириллович
• Шифр специальности: 02.00.15
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 227 с.

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Понятие стабильности ферментов

2.2. Стабильность ферментов в органических средах

2.3. Подходы к стабилизации ферментов в органических средах

2.4. Обращенные мицеллы полимерных ПАВ

2.4.1. Выбор полимера, способного к мицеллообразованию

2.4.2. Получение и свойства полимерных ПАВ

2.4.3. Системы обращенных мицелл полимерного ПАВ

2.5. Нековалентные комплексы полиэлектролитов

2.5.1. Интерполиэлектролитные комплексы

2.5.2. Белокполиэлектролитные комплексы
2.5.3. Каталитические свойства и стабильность ферментов в комплексе с полиэлектролитом
3. Постановка задачи
4. Выбор объектов исследования
5. Основные методы
5.1. Синтез полимерного ПАВ ЦЭПЭИ
5.2. Определение кислотности цэпэи и ее регуляция
5.3. Приготовление раствора обращенных мицелл полимерного ПАВ
5.4. Измерение размеров обращенных мицелл полимерного ПАВ
5.5. Измерение каталитической активности ферментов
5.6. Стабильность ферментов в системе обращенных мицелл полимерного ПАВ
5.7. Сухой комплекс фермента с полимером
5.8. Ферментативный гидролиз бтна в мембранном реакторе
5.9. Приготовление комплексов ферментов с полиэлектролитами для использования в гомогенных биокаталитических системах
5 Изучение комплекса ХТ с ПБ методом флуоресцентной спектроскопии с использованием эозина
5 Седиментационный анализ комплексов ХТ и ПВП
5 Каталитическая активность препаратов хт в гомогенных водноорганических смесях
5 Каталитическая активность препаратов трипсина в гомогенных водноорганических смесях
5 Каталитическая активность препаратов ПРХ в гомогенных водноорганических смесях
5 Ацилирование аминогрупп ХТ
5 Восстановительное алкилирование аминогрупп ХТ глицериновым альдегидом
5 Определение степени модификации препаратов ХТ
5 Определение концентрации активных центров в 0 препаратах ХТ
5 Флуоресцентная спектроскопия
5 Спектроскопия кругового дихроизма
5 Вторая производная уф спектров белка
5 Твердофазный иммуноферментный анализ в водно 2 органических средах
5 Приготовление и исследование биосенсора на этанол
5 Приготовление суспензий препаратов ферментов
5 Приготовление растворов для проведения реакции 4 пептидного синтеза ацетил1тирозин1лизинамида
5. Приготовление растворов для проведения реакции
пептидного синтеза этилового эфира Ыацетил1тирозил1лейцина
5 Определение каталитической активности суспензий
препаратов ХТ в средах с высоким содержанием органического растворителя
6. Результаты и обсуждение
6.1. Обращенные мицеллы полимерного ПАВ
6.1.1. Синтез полимерного ПАВ и оптимизация системы.
6.1.2. Свойства ферментов, включенных в обращенные 4 мицеллы полимерного ПАВ
6.1.2.1. Влияние на каталитические параметры 4 ферментов
6.1.2.2. Влияние концентрации воды на каталитические 8 параметры ферментов
6.1.2.3. Стабильность ферментов в системе обращенных 9 мицелл полимерного ПАВ
6.1.3. Сухой комплекс ХТЦЗПЭИ
6.1.4. Катализ ХТ, включенным в обращенные мицеллы 4 полимерного ПАВ, в мембранном реакторе
6.2. Гомогенные биокаталитические системы
6.2.1. Кинетические эффекты комплексообразования
6.2.2. Область существования ферментполиэлектролитных 1 комплексов в гомогенных водноорганических смесях
6.2.2.1. Метод скоростной седиментации
6.2.2.2. Метод флуоресцентной спектроскопии
6 2.3. Природа взаимодействий фермента с
полиэлектролитом в водноорганических смесях
6.2.4. Факторы, определяющие наличие и величину 7 кинетических эффектов комплексообразования
6.2.4.1. Природа органического растворителя
6.2.4.2. Состав и свойства водной фазы
6.2.4.3. рНЭффекты
6.2.4.4. Природа полиэлектролита и его содержание в 0 системе
6.2.4.5. Природа фермента
6.2.4.6. Природа субстрата .
6.2.5. Молекулярные причины кинетических эффектов
комплексообразования
6.2.5.1. Флуоресцентная спектроскопия
6.2.5.2. Спектроскопия кругового дихроизма
6.2.5.3. Вторая производная УФ спектра белка
6.3. Гетерогенные белоксодержащие системы
6.3.1. Стабилизация антител
6.3.2. Оптимизация ферментсодержащего покрытия 6 электрода
6.3.3. Ферментполиэлектролитные комплексы как 8 катализаторы пептидного синтеза
6.3.3.1. Комплексы ХТ с полиэлектролитами как 9 катализаторы синтеза этилового эфира Мацетил1тирозил1лейцина
6.3.3.2. Двойные комплексы ХТ с полиэлектролитами как
катализаторы синтеза Мацетил1тирозил1лизинамида Выводы
Список литературы


Основными факторами, определяющими результат контакта биокатализатора с растворителями, являются природа органического растворителя, содержание воды в системе и природа фермента. Органические растворители различаются по степени влияния на белок. Так, полярные растворители контактируют с молекулами биокатализатора и способны непосредственно воздействовать на фермент, в то время как неполярные, не смешивающиеся с водой растворители, в большинстве случаев инертны по отношению к биокатализатору в силу пространственного разделения компонентов системы. Природа используемого органического растворителя и содержание воды задают фазовое состояние системы, исключительно важный параметр, в значительной степени определяющий свойства биокатализатора, включая его нестабильность. Как отмечалось выше, в настоящее время в литературе описаны многочисленные биокаталитические системы в органических средах. Их анализ вряд ли возможен без классификации по тому или иному признаку. Нам представляется одним из основополагающих признаков именно фазовое состояние системы. Классификация биокаталитических систем в органических средах на основании фазового состояния системы приведена на рис. Рис. Классификация биокаталитических систем в среде органических растворителей. Например, гидрофильные белки в практически безводных неполярных растворителях образуют суспензии. В то же время, белки с протяженными гидрофобными участками на поверхности и липопротеины в тех же средах могут образовывать микроэмульсионные системы. Также следует помнить, что часто исследователи имеют дело не с индивидуальными ферментами, а с их препаратами, которые могут быть загрязнены сопутствующими соединениями. Эти вещества также могут оказывать влияние на агрегатное состояние системы. С учетом вышесказанного, ниже, на основании классификации, приведенной на рис. В случае смешивающихся с водой органических растворителей агрегатное состояние биокаталитической системы зависит от содержания воды. Обычно на зависимости каталитической активности от содержания воды можно выделить три участка рис. В области 1 при умеренном содержании органического компонента ферменты сохраняют значительную каталитическую активность. При увеличении концентрации органического растворителя наблюдается полная или практически полная инактивация биокатализатора область 2. При переходе к системам с крайне низким содержанием воды каталитическая активность восстанавливается область 3, однако агрегатное состояние систем в областях 1 и 3 различно. Гомогенные растворы ферментов. При умеренном содержании большинства растворителей образуются истинные растворы ферментов, то есть гомогенные биокаталитические системы рис. Ацетонитрил, об. Рис. Зависимость скорости гидролиза АТЭЭ, катализируемого ХТ, от концентрации ацетонитрила в смеси с водой. Из работы . Однако такой вид зависимости не является единственно возможным. Переход от водных растворов к водноорганическим смесям может приводить к монотонному снижению каталитической активности , или активации фермента по сравнению с водным уровнемобычно в интервале концентраций до об. Причины активации, наиболее часто обсуждаемые в литературе, суммированы в работе . Присутствие в среде органических растворителей оказывает влияние не только на каталитические стадии, но и на процесс образования ферментсубстратного комплекса, что необходимо учитывать, когда фермент функционирует в режиме тКм. Влияние органического растворителя на процесс связывания двояко. Вопервых, органические растворители могут непосредственно влиять на эффективность контакта участников биокаталитической реакции, поскольку связывание осуществляется за счет невалентных взаимодействий электростатических и гидрофобных При этом определяющим становится природа таких взаимодействий при гидрофобном связывании величина Км при переходе от водных растворов к водноорганическим смесям обычно возрастает , при электростатическом уменьшается . Вовторых, присутствие органических растворителей изменяет растворимость субстрата и его распределение в системе при этом гидрофильные субстраты концентрируются у поверхности фермента, а гидрофобные преимущественно локализованы в объеме растворителя , .