Ацилирование аминосоединений в водной среде под действием пенициллинацилаз

• Автор: Химюк, Андрей Ярославович
• Шифр специальности: 02.00.15, 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 129 с.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Пепициллннацнлазы.

1.1.1. Общие свойства

1.1.2. Строение активного центра А по данным РСЛ.X

1.1.3. Механизм катализа

1.1.4. рНпрофиль каталитической активности и стабильности ПА.

1.1.5. Субстратная специфичность

1.1.6. Стереоспецнфичность

1.2. Пеницмллинлцилазы в реакциях синтеза.

1.2.1. Синтез Рлактамных антибиотиков

1.2.1.1. Кинетические закономерности ацильного переноса на ядра антибиотиков.
1.2.2. Ацилированне аминососдиненин.
1.3. Ферменты в тонком органическом синтезе
1.3.1. Использование ферментов в реакциях конденсации.
1.3.1.1. Селективное ацилированне полифункцнональных субстратов
1.3.2. Ферментативное получение оптически активных соединений.
ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Материалы
2.2. Методы.
2.2.1. Определение активности пеннцнллннацнлаз
2.2.2. Определение компонентов реакционной смеси методом ВЭЖХ.
2.2.3. Определение оптической чистоты аминососдиненин.
2.2.4. Изучение растворимости компонентов реакции.
2.2.5. Исследование кинетических закономерностей реакций ферментативного ацильного
переноса .
2.2.5.1. Определение зависимости соотношения начальных скоростей синтезагидролиза от концентрации амнносоединения
2.2.5.2. Определение соотношения констант специфичности при ферментативном
пиролизе ацильного донора и продукта переноса
2.2.6. Слежение за реакцией синтеза ацильных производных аминов и аминокислот.
2.2.7. Хемоэнзи.чатнчсскнй синтез днкстопнпсразннов
2.2.8. Слежение за ферментативным гидролизом рацематов Каиильных производных
амипососдинений.
2.2.9. Получение рацематов Яфснплглицильных производных амнносоедннений
2.2 Разделение эиаптиомеров ОСРЕА.
ш
2.2.1. Разделениеэнантиомеров 2амнно4фенилбтана
2.2 Разделение энантиомеров 2амнно1 бутанола.
2.2 Обработка результатов и вычисления
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Кинетические закономерности реакций ацильною переноса на аминосоединешш, катализируемого пеннциллинацилазой.
3.1.1. Ацилированне аминокислот .
3.1.2. Ацилированне аминов и амнноспиртов
3.1.3. Стереоселективнос ацилированне аминосоединсннн
3.1.3.1. Установление кинетической схемы
3.1.3.2. Энантиосслсктивность реакций ферментативного ацильного переноса по отношению к нуклеофилу5Х
3.1.3.3. Стсреосслективное ацилированне аминосоединешш при использовании феннлглнцннамнда в качестве ацильного донора
3.2. Влияние структуры ацильного донора в реакциях ацилнрованни
3.2.1. Характеристика доноров ацильной части.
3.2.2. Зависимость эффективности и стерсоселсктивности ацильного переноса от природы
донора .
3.3. Моделирование интегральной кинетики ацилиропанпя аминосоединсннн
3.4. Влияние различных факторов на эффективность стереоселективного
анили ронання
3.4.1. Влияние растворимости ацнлнрованного продукта.
щ 3.4.2. Влияние концентраций реагентов
3.4.3. Влияние ионной силы и температуры.
3.4.4. Использование нативных и иммобилизованных препаратов пеницнллинацилазы
3.5. Синтез стереоизомсрно чистых соединений при использовании пеннциллннацнлаз.
3.5.1. Синтез ацнльных производных аминокислот.
3.5.2. Региоселективнос ацилированне аминогрупп лизина и орнитнна
3.5.3. Хемоэнзнматнческий синтез дикетопиперазинов
3.6. Получение энантиомеров аминов и амнноспиртов при использовании пеннциллннацнлаз.
3.6.1. Выбор донора ацильной части
3.6.2. Интегральный биокаталитический метод.
3.6.3. Модификация интегрального бнокаталитичсского метода. Циклический подход
3.6.4. Сравнение методов получения индивидуальных энантиомеров
ПРИЛОЖЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Предложенный интегральный метод получения индивидуальных энантиомеров аминосоединений, сочетающий ферментативную реакцию стереоселективного ацилирования их рацематов и последующего ферментативного дсацилирования в водной среде, по своей эффективности значительно превышает другие известные примеры из научной и патентной литературы в области препаративной хиротехнологии. Пенициллинацилаза ПА относится к классу гидролаз, подклассу амидогидролаз К. Ф.3. Впервые ПА выделили в х годах из грибов ii i и i i 1, 2. В дальнейшем ее обнаружили у разных микроорганизмов 3, 4, 5. По принятой классификации, основанной на субстратной специфичности, различают пенициллнн, пенициллинV и ампициллинацилазы 3, 4, 6, 7, 8. Существуют также ферменты, не попадающие ни в одну из этих групп 6. Уникальность свойств ПА заключается в том, что они катализируют расщепление только одной, более стабильной из двух амидных связей пенициллина. Расщепление лабильной лактамнои связи пенициллинового ядра приводит к полной потере его антибиотических свойств. ПА из ii i является одним из первых ферментов, для которых первичная структура была определена методом секвенмрования гена 9. Зрелый фермент из . Да и . Да, соответственно 9, которые получаются в результате активации общего мембранносвязанного предшественника 9, , , , , , . Предшественник синтезируется как полипептид кДа, состоящий из сигнального пептида, содержащего аминокислот а. После устранения сигнального пептида предшественник проходит через цитоплазматическую мембрану в периплазматическое пространство, где в ходе последовательности специфических расщеплений предшественника образуются а и субъединицы , . При этом асубъединица сворачивается первой и служит матрицей для сворачивания субъединицы , , . ПА является автокаталитическим , , , ,. Рассмотренный механизм биосинтеза обычно встречается при образовании вирусных белков или полипептидных гормонов в эукариотических клетках , аналогичен процессингу сериновых протеаз эукариот , но редко встречается в бактериях , . В настоящее время определены первичные структуры ПА из i i , . ПА является серии каталитический центр. ПА из . Особенностью ПА из . Этим авторы объясняют значительную термостабильность ПА из . Физиологическая роль ПА до настоящего времени не установлена. Существует несколько предположений резистентность к пенициллинам метаболизированис ФУК в качестве единственного источника углерода и энергии связь с белковым метаболизмом клетки 4. Опубликованные в году данные по рентгеноструктурному анализу РСА ПА из . ФУК, фенилметилсульфонил фторидом и другими ингибиторами позволили сформировать основные представления о структуре и гипотезу о механизме каталитического действия данного фермента. Рис. Общий вид гетеродимера пенициллинацилазы из . РСА. Усредненные размеры составляют xx А. Синим цветом показана асубъединица, красным iсубъединица фермента. Гетеродимер пенициллинацилазы состоит из двух тесно переплетенных цепей без очевидных дискретных областей с глубокой чашеобразной выемкой в центре рис. Из анализа струкгуры комплекса фермента с ФУК, являющейся сильным конкурентным ингибитором, следует, что связывание субстрата происходит внутри выемки, на дне которой находится гидрофобный карман, образованный многочисленными ароматическими аминокислотными остатками. Фенильная часть ингибитора направлена внутрь этот кармана, а карбоксильная группа взаимодействует с ссрином И. Специфичность фермента к фенилацетильной группе объясняется комплементарностью фен и л ацетильного остатка и участка связывания ацильной группы субстрата активного центра фермента. Предполагается, что нуклеофильность гидроксильной группы Ыконцевого серина И увеличивается за счет взаимодействия с собственной ааминогруппой при участии молекулы воды . Рис. Предполагаемый механизм катализа пенициллинацилазой . В ранних работах по изучению ПА показано, что ФМСФ специфический реагент на гидроксильную группу серина ковалентно модифицирует ПА из . ПА, протекают через образование ацилферментного комплекса . Позднее было найдено, что именно концсвой цспи является нуклеофилом активного центра ПА замена на цистеин сайтнаправленным мутагенезом ПА из . ПА из . Анализ структуры продукта взаимодействия I с ФМСФ.