Фосфолипаза А : Роль окисления фосфолипидов in vitro и in vivo в регуляции фосфолиполиза

• Автор: Купцова, Ольга Сергеевна
• Шифр специальности: 02.00.15, 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 150 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ.
ЛИТЕРАТУРЫ.

СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН.

1.1 Клетки мешки с ферментами или нечто большее

1.1.1 Структура биомембран.

1.1.2 Функции биологических мембран.

1.1.3 Биомембраны и сигнальная трансдукция в клетках.

I.3 Искусственные мембраны

1.3.1 Мономолекулярные слои.

1.3.2 Плоские бислойные мембраны

1.3.3 Липосомы

Методы изучения упаковки и движения липидных молекул
в мембранах.Использование пиреновых зондов в модельных мембранах
II. ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ
2.1 Инициация липидного перекисного окисления супероксидным и иергидроксидным радикалами.
2.2 Инициация окисления липидов перекисью водорода и гидроксильными радикалами.
2.3 Инициация окисления липидов синглетным кислородом и
озоном.
2 4 Роль переходных металлов в инициации липидног о окисления.
2.5 Изучение окисления фосфолипидов i viv.
2.6 Окисление фосфолипидов i vi.
III ФОСФОЛИПАЗА А2 СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА.
3.1 Типы.фосфо липаз А2.
3.2 ФЛА2 в растительных клетках.
3.3 Участие фосфолилазы Л2 в передаче сигналов
3.4 Структура фосфолипазы Л
3.5 Активный центр
3.6 Кальцийсвязываюший центр.
3.7 Центр узнавания поверхности раздела
3 8 Вторичный кальцийсвязывающий центр
3.9 Механизм катализа
3. Кинетическая модель липолиза.
3. Методы детекции активности фосфолипаз.
3. Свойства мембранного бислоя и реакционная способность фосфолипазы А2.
3 Фосфолипаза А2 и окисленные фосфолипиды история вопроса
ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ,.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1 МАТЕРИАЛЫ
. МЕТОДЫ.
2.1 Приготовление липосом
2.2 Окисление фосфолипидов.
2.3 Изучение катализируемого фосфолипазой А2 липолиза в липосомах, состоящих из ПОРС1ЮРСох и БАРСАРСох методом
флуоресцентного замещения ПАША
2.4 Изучение катализируемого фосфолипазой А2 гидролиза Ь.яВСЮРУ СИ РС, включенного в липосомы, состоящие, из ООРОООРСох и ЗАРСБАРСох.
2.5 Изучение катализируемого фосфолипазой А2 гидролиза
ЗАРСБАРСох в мицеллах гликохолата натрия
2.6 Анализ продуктов реакции, катализируемой фосфолипазой А2.
2 7 Изучение структуры липосом.
2.7.1 Микровязкость соотношение интенсивностей флуоресценции
эксимермономер для с1Руг4РС и РугюРС в липосомах
2.7.2 Латеральная подвижность варьирование конценграции
шопоРугюНРС
2 8 Изучение фосфолипазной активности в клетках ВУ2.
2.8.1 Культивирование клеток.
2.8.2 Введение флуоресцентного зонда ЬяВСЮРУ С РС в клетки ВУ2.
2.8.2 1 Приготовление липосом, содержащих ЬвВООРУ С 1 РС.
2.8.2 2 Введение iI i в клетки Определение
оптимального времени инкубации клеток с зондом.
2.8.3 Инкубирование клеток с Са2 мастопараном и ингибиторами
2.8.4 Окисление мембранных липидов.
2.8 5 Конфокальный лазерный микроскоп
2.8 6 Флуориметрические измерения
2.8.7 Анализ флуоресцентных продуктов фосфолипазной
активности в клетках
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
I ФОСФОЛИПАЗА А2 ИЗ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
СВИНЬИ ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТА С НЕОКИСЛЕННЫМИ И ОКИСЛЕННЫМИ ФОСФОЛИПИДАМИ. . .
1.1 Изучение фосфолиполиза в липосомах, состоящих из x и 0x, методом флуоресцентного
замещения .
1.2 Изучение липолизаiI СП , включенного
в липосомы, состоящие из x и 0X
1.3 Изучение фосфолиполиза в липосомах и АРСох
1.4 Анализ продуктов реакции, катализируемой свиной панкреатической фосфолипазы А
II. ФОСФПОЛИПАЗА Л2 ИЗ I
I ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
ФЕРМЕНТА С НЕОКИСЛЕННЫМИ И
ОКИСЛЕННЫМИ ФОСФОЛИПИДАМИ
2.1 Изучение фосфолиполиза в липосомах, состоящих из x и x, методом флуоресцентного замещения .
2.2 Изучение гидролиза x фосфолипазой А
в мицеллах гликохолага натрия.
2.3 Изучение липолиза iI 1 , включенного
в липосомы, состоящие из x и 0X
III. СТРУКТУРА ЛИПОСОМ, СОСТОЯЩИХ ИЗ ОКИСЛЕННЫХ ФОСФОЛИПИДОВ МИКРОВЯЗКОСТЬ И ЛАТЕРАЛЬН.АЯ ДИФФУЗИЯ
3 .1 Микровязкость, соотношение интенсивностей
флуоресценции эксимермономер для i и ii в липосомах .
3 .2 Измерения латеральной подвижности
IV. ПРИРОДНЫЕ ФОСФОЛИПИДЫ ДЕЙСТВИЕ ФОСФОЛИПАЗЫ Л2 И СТРУКТУРА ЛИПОСОМ.
4.1 Изучение фосфолиполиза в липосомах, состоящих
из природных фосфолипидов.
4.2 Микровязкость в липосомах, состоящих из природных фосфолипидов
V. ФОСФОЛИПАЗА А2 В КЛЕТКАХ 2. ДЕТЕКЦИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТА I VIV. ВЛИЯНИЕ ОКИСЛЕНИЯ МЕМБРАННЫХ ФОСФОЛИПИДОВ НА АКТИВНОСТЬ ФОСФОЛИПАЗЫ Л2.
5.1 Детекция активности ФЛА2 в клетках 2.
5.2 Стимуляция активности ФЛА мастопараном.
5.3 Влияние окисления мембран на активность ФЛЛ2 в клетках 2.
ВЫВОДЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Некоторые их этих ферментов катализируют трансмембранные реакции между реагентами на обеих сторонах мембраны или участвуют в активном транспорте другие участвуют в последовательных реакциях, затрагивающих целую серию ферментов, расположенных в плоскости мембраны, третьи имеют мембраносвязанные субстраты и или участвуют в биосинтезе, липолизе или перестройке мембран. Для большого разнообразия клеточных процессов, протекающих в гшоскостина поверхности мембраны, существенным фактором является латеральная диффузия мембранных компонентов. Трансдукция сигналов это процесс передачи внеклеточных сигналов, которые инициируют метаболические или физиологические изменения в клеткахмишенях. Внеклеточные химические переносчики включают гормоны, факторы роста, нейротрансмиттеры и ферромоны, которые взаимодействуют со специфическими рецепторами в плазматической мембране, инициирующими специфические метаболические отвегы в клетках. В ответ на действие гормонов клетка включает синтез внутриклеточного вторичного переносчика . Вкратце, процесс обычно описывается следующей последовательностью событий 1 связывание гормона с рецептором 2 индуцированное связывание белка в состоянии покоя это тримерный комплекс с ое Р и у субъединиц с комплексом гормонрецептор процесс инициируется конформационным изменением рецептора 3 индуцированный обмен на , за которым следует высвобождение субъединицы внешний мембранный белок с липидным якорем 4 латеральная диффузия к эффектору чаще всего фермент, связывание с ним и инициация образования вторичного переносчика. Вторичные переносчики, в свою очередь, активируют одну или более протеинкиназ, фосфорилирование которых промотирует или ингибирует ферментативные реакции и другие ответы клетки. Хорошо известно, что мобильные рецепторы находятся в плазматической мембране . Более того, исследования хорошо изученных клеточных систем указывают на то, что рецептор, белки и эффекторы находятся в плазматической мембране в организованном состоянии , а точнее, нахождение этих компонентов ограничено доменами, в пределах которых они мобильны и реакционноспособны. Кроме того, оказывается, что латеральная сегрегация или агрегация ограничивает и даже запрещает подвижность рецепторов и белков в плоскости мембраны , этот механизм может отвечать за противодействие гормональной трансдукции . Рассмотрим теперь методы моделирования мембран и структурные характеристики бислоя. Наиважнейшие компонентов мембран, липиды низкомолекулярные вещества, близкие по своим свойствам к жирам . Как известно, липидная молекула построена из несущей электрические заряды полярной головки и длинных углеводородных хвостов. Для мембранных липидов наиболее характерны производные сахаров и фосфорной кислоты глико и фосфолипиды . Среди мембранных липидов наиболее распространены глицеролипиды содержанте остаток глицерина и производные аминоспирта сфингозина сфинголипиды рис. В одной мембране могут сосуществовать более сотни неодинаковых по структуре липидных веществ . В водной среде их молекулы объединяются друг с другом в мицеллы ,, а если концентрация липидов в воде высока, образуется бимолекулярный слой бислой . Такие слои, наслаиваясь друг на друга, образуют мюгослойные липидные образования сложной структуры. Более простые структуры образуются, если распылить раствор липидов в летучем органическом растворителе в водной среде или в процессе набухания воднолипидную смесь подвергать действию ультразвука. В этом случае образуются маленькие замкнутые частицы везикулы, состоящие из одной бимолекулярной липидной оболочки и внутреннего водного пространства рис. З. Наиболее распространенные в природе фазовые состояния липидов в природе гелеобразное и жидкокристаллическое. Переход твердой фазы в жидкую происходит в некотором температурном интервале, зависящем от природы углеводородных цепей . Мембраны, состоящие из смеси ненасыщенных и насыщенных целей, при той же температуре являются более жидкими, чем мембраны, построенные из одних только насыщенных цепей ,. Это явление имеет огромное значение для нормальной работы биологических мембран в живой клетке.