Расщепление РНК конъюгатами на основе 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана и антисмысловых олигонуклеотидов, несущих остатки имидазола

• Автор: Белоглазова, Наталья Геннадьевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 183 с.

Введение
Глава 1. Вирус гриппа, как мишень для действия антисмысловых олигонуклеотидов обзор литературы.

1.1. Разнообразие ортомиксовирусов.

1.2. Биологические свойства вируса гриппа

1.2.1. Структура вириона вируса гриппа.

1.3. Структура генома, кодируемые белки и их функции.

1.3.1. Организация генома вируса гриппаv.

1.3.2. Белки полимеразного комплекса и их гены.

1.3.3. Белок нуклеокапсида и кодирующий его ген

1.3.4. Геммаглютинин и его ген.

1.3.5. Гидролитическая активация НА и ее связь с патогенностью вирусов гриппа.

1.3.6. Нейраминидаза и кодирующий ген
1.3.7. 7ой сегмент геномной РНК вируса гриппа структура и кодируемые белки
1.3.7.1. М1белок матрикса.
1.3.7.2. Строение и функция белка М2.
1.3.8. 8ой сегмент геномной РНК вируса гриппа структура и кодируемые белки.
1.3.8.1. Белок 1.
1.3.8.2. Белок 2.
1.4. Жизненный цикл вируса гриппа
1.4.1. Адсорбция вируса, проникновение в клетку и распаковка вирусной частицы
1.4.2. Особенности репродукции вируса гриппа.
1.4.2.1. Синтез вирусных мРНК
1.4.2.2. Репликация вирионной РНК
1.4.3. Регуляция экспрессии вирусных белков в инфицированных клетках
1.4.4. Внутриклеточный транспорт вирусных белков, сборка вириона и почкование.
1.4.4.1. Ядерноцитоплазматический транспорт вирусных белков.
1.4.4.2. Внутриклеточный транспорт интегральных белков вириона.
1.4.4.3. Функциональная роль белка 1 в регуляции экспрессии вирусных и клеточных генов
1.4.4.4. Регуляция уровня сплайсинга мРНК 1 и М2.
1.4.4.5. Влияние вируса гриппа на экспрессию клеточных белков
1.4.4.6. Сборка геномных сегментов и формирование вирионов
1.5. Применение антисмысловых олигонуклеотидов для подавления репродукции вируса гриппаТ
1.5.1. Антисмысловые олигонуклеотиды в качестве антивирусных препаратов
1.5.2. Использование рибозимов для подавления развития вируса
гриппа.
Глава 2. Экспериментальная часть
2.1. Материалы
2.1.1. Реактивы и препараты.
2.1.2. Плазмиды.
2.1.3. Олигонуклеотиды
2.1.4. Буферные растворы, использованные в работе.
2.2. Методы.
2.2.1. Рестрикционный анализ плазмидных ДНКТ
2.2.2. Клонирование М2 РНК вируса гриппа
2.2.3. Получение РНК с помощью транскрипции i vi
2.2.4. Получение радиоактивномеченых препаратов РНК и
олигонуклеотидов.
2.2.5. Изучение вторичной структуры М2 РНК вируса гриппа методом
пробинга.
2.2.6. Расщепление РНК искусственными рибонуклеазами
2.2.7. Синтез коньюгатов олигонуклеотидов и имидазолсодержащих
конструкций
2.2.8. Сайтнаправленное расщепление РНК с помощью коньюгатов олигонуклеотидов
2.2.9. Ингибирование сайтнаправленного расщепления конъюгатом 2В.
2.2 Молекулярное моделирование
2.2 Гельэлектрофорез.
Глава 3. Химические рибонукпеазы коньюгаты 1.4 диазабицикло2.2.2октана и имидазола, как зонды для исследования структуры РНК в растворе Результаты и обсуждение.
3.1. Дизайн химических рибонуклеаз
3.2. РНК модели.
3.3. Схема эксперимента.
3.4. Расщепление РНК под действием искусственных рибонуклеаз
3.4.1. Специфичность расщепления РНК соединениями 3.г
3.4.2. Влияние вторичной структуры РНК на специфичность и эффективность расщепления.
3.4.3. Влияние концентрации соединений 3 на скорость расщепления РНК.
3.4.4. Кинетика расщепления РНК соединениями
3
3.4.5. Эффективность расщепления РНК искусственными
рибонуклеазами.
3.4.6. Доказательство каталитического характера расщепления фосфодиэфирных связей в РНК под действием 3.
3.4.7. Доказательство того, что расщепление РНК происходит под действием искусственных рибонуклеаз.
3.5. Влияние условий проведения реакции на процесс расщепления РНК искусственными РНКазами.
3.5.1. Влияние природы буфера на расщепление РНК соединениями
3.5.2. Влияние на скорость расщепления РНК соединениями 3.
3.5.3. Влияние температуры на эффективность расщепления фосфодиэфирных связей в РНК соединениями 3.
3.6. Механизм расщепления РНК под действием химических рибонуклеаз
3.7. Применение искусственных рибонуклеаз для исследования пространственной структуры РНК в растворе.
3.7.1. Пробинг вторичной структуры i vi транскриптов митохондриальных тРНК, дикого типа и содержащего замену А9С
3.7.2. Пробинг вторичной структуры М2 РНК вируса гриппа
Глава 4. Направленное расщепление РНК коньюгатами антисмысловых олигонуклеотидов с имидазолсодержащими конструкциями
4.1. Синтез коньюгатов олигонуклеотидов путем постсинтетической модификации и выбор РНК мишени.
4.2. Направленное расщепление дрожжевой тРНКРЬе коньюгатами с моно и бисимидазолсодержащими конструкциями.
4.2.1. Специфичность и эффективность расщепления тРНК коньюгами олигонуклеотидов, несущих моно и бисимидазолсодержащие
конструкции.
4.2.2. Кинетические и концентрационные закономерности расщепления РНК коньюгатом
4.2.3. Влияние природы буфера на скорость направленного расщепления РНК
4.2.4. Доказательство протекания расщепления РНК в составе комплементарного комплекса
4.2.5. Расщепление высокомолекулярных РНК коньюгатами олигонуклеотидов и имидазолсодержащих конструкций.
4.3. Сайтнаправленное расщепление РНК с помощью коньюгатов олигонуклеотидов, несущих и мидазол содержащие дендримерные
конструкции.
4.3.1. Дизайн коньюгатов олигонуклеотидов, содержащих от 2х до х остатков имидазола
4.3.2. Постановка эксперимента.
4.3.3. Исследование сайтнаправленного расщепления тРНК коньюгатами
олигонуклеотидов с дендримерными имидазолсодержащими химическими
конструкциями
4.3.4 Ингибирование сайтнаправленного расщепления тРНКр,1в коньюгатами
4.3.5. Расщепление тРНКРЬе коньюгатами, несущими бисимидазолсодердащие конструкции 2Вс2т.
4.3.6. Направленное расщепление тРНКРЬе коньюгатами, несущими тетраимидазолсодердащие конструкции 2Вс4т.
4.3.7. Направленное расщепление тРНК коньюгатами, несущими от 8и до х остатков имидазола в составе гидролизующей конструкции.
4.3.8. Влияющие условий проведения реакции и структуры коньюгатов 2Вб1кт на эффективность направленного расщепления
тРНКРЬе
4.3.9. Молекулярное моделирование искусственных РНКаз
Выводы.
Список литературы


В каждом сегменте гексануклеотид в положениях , считая от 3конца, комплементарен гексануклеотиду, расположенному в последовательности у 5конца. Концевые последовательности всех сегментов геномных РНК одинаковы у разных штаммов и подтипов вируса гриппа типа А, в то время, как уникальные последовательности значительно различаются. На бконце все сегменты содержат тетрафосфат рррАр, на 3конце нефосфорилированный уридин. ОААСАААБАиСАррр
А
Г
нуклеотиды
ссиисииисиАси

Репликация

Транскрипция
Рис. Схема, показывающая различия между вирионной РНК вРНК, мРНК и кРНК вируса гриппа А и механизм передачи генетической информации вируса гриппа Б. Показаны 3 и бконцевые консервативные последовательности, состоящие из и нуклеотидов, соответственно. РНК вируса содержат кэп т7СрррХтструктуру и нуклеотидов, происходящие из клеточных мРНК. Полиаденилирование мРНК происходит на расстоянии нуклеотидов от 5конца вРНК. В препаратах вирионной РНК присутствуют только нити одной полярности , самопроизвольный отжиг РНК не приводит к образованию двуцепочечных гибридов. Геномная РНК вируса гриппа вРНК выполняет двойную функцию она одновременно служит матрицей для синтеза вирусных мРНК во время вирусспецифической транскрипции и полноразмерных копий вРНК кРНК, цепь рис. Три сегмента геномной РНК кодируют белки РВ1, РВ2 и РА, образующие вирусный РНКзависимый полимеразный комплекс таблица 1. Два полипептида Р являются относительно основными, а один из полипептидов Р относительно кислый . Таблица 1. Сегмент Длина муклсотидои Длина мРНК нуклеотидов6 Кодируемый белок i белка аа0 Мол. РВ2 9 0 м. РВ1 7 . РА 6 . НА 4 . Неструктурный белок вириона обнаружен в ядре инфицированной клетки ингибирует экспорт полиАсодержащих мРНК и сплайсинг мРНК. Минорный белок вириона. Р, кодируемый 3м сегментом РНК, РА. Сегменты РНК 1 и 2 имеют длину нуклеотид и кодируют белки, состоящие из 9 и 7 аминокислот, соответственно. Оба белка при 6. Третий сегмент РНК состоит из нуклеотидов, кодирующих белок длино 6 аминокислот с зарядом ,5 при 6. Из трех белков, образующих полимеразный комплекс вируса гриппа, только РВ1 обладает каталитической активностью и принимает непосредственное участие в синтезе, как геномной, так и матричной РНК . Известные РНКзависимые РНКполимеразы различных вирусов имеют в своем составе четыре консервативных участка . Анализ активности мутантных форм белка РВ1, показал, что аминокислоты кодируемые консервативными последовательностями крайне важны для осуществления белком его каталитической функции . Белок нуклеокапсида нуклеопротеин ЫР один из основных структурных белков вируса гриппа, по содержанию в вирионе уступает только матриксному белку Мт таблица 1. Нуклеопротеин представляет собой полифункциональный РНКсвязывающий белок, основная роль которого состоит в инкапсулировании вирусного генома для транскрипции, репликации и упаковки в вирионы . Белок ИР закодирован в 5 сегменте геномной РНК, длина которого составляет 1 5 нуклеотидов. Нуклеопротеин состоит из 8 аминокислот и обладает мол. Да. Последовательность белка ЫР характеризуется высоким содержанием остатков аргинина, в результате чего молекула несет при нейтральных значениях суммарный заряд . Многочисленные остатки аргинина и других основных аминокислот распределены в последовательности МР относительно равномерно. Отсутствие в этом РНКсвязывающем белке кластеров, образованных основными аминокислотами указывает на то, что взаимодействие ЫР с сегментами геномной РНК в составе нуклеопротеидных комплексов осуществляется посредством многочисленных точечных контактов. Часть молекул нуклеопротеина в составе вириона фосфорилирована . Уровень фосфорилирования белка ИР и функциональная роль фосфорилирования до конца не выяснены , хотя предполагается, что фосфорилирование необходимо для экспорта ЫР в ядро и для регуляции его удержания в ядре . Известно, что синтез вирусного нуклеопротеина происходит в цитоплазме инфицированной клетки, после чего белок транспортируется в ядро. Способность к селективному проникновению в ядро является уникальным свойством белка , .