Синтез и исследование свойств конъюгатов олиго- и полинуклеотидов с низкомолекулярными лигандами

• Автор: Прохоренко, Игорь Адамович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 127 с. : ил.

Введение

ГЛАВА 1. Синтез, свойства и применение конъюгатов олигонуклеотидов с

флуоресцентными красителями обзор литературы

1.1 Присоединение активированных производных флуоресцентных красителей

к олигонуклеотидам с функциональными группами

1.1.1 Методы присоединения красителей по алифатической аминогруппе и реагенты для с введения в олигонуклеотиды

1.1.2 Методы введения в олигонуклеотиды тиольной группы

1.1.3 Модифицирующие реагенты для получения конъюгатов олигонуклеотидов с красителями с помощью реакций циклоприсоединения
1.2 Методы прямого введения производных красителей в олигонуклеотиды с помощью модифицирующих тврдофазных носителей и амидофосфитных реагентов.

1.2.1 Флуоресцеин и другие ксантсновые красители

1.2.2 Пирен и другие полициклические ароматические углеводороды

1.2.3 Цианиновыс красители
1.3 Взаимодействие флуорофоров, присоединенных к ДИК, с сенсибилизаторами, тушителями, другими флуорофорами.
1.3.1 Резонансный перенос энергии флуоресценции в исследовании
нуклеиновых КИСЛОТ
1.3.1.1 еразветвленные комплексы НК
1.3.1.2 Разветвленные комплексы НК
1.3.1.3 Взаимодействие НК с белками и рибозимами
1.4 Применение резонансного переноса энергии флуоресценции для в ДНКдиагностнке.
1.5 Взаимодействие двух одинаковых флуорофоров эксимерная
флуоресценция.
ГЛАВА 2. Синтез модифицирующих реагентов. Синтез и изучение свойств флуоресцентно меченных олигонуклеотидных конъюгатов результаты и обсуждение
2.1 Синтез модифицирующих реагентов на основе гидроксипролинола.
2.1.1 Синтез пирснсодсржащего фосфамидитного реагента на основе гидроксипролинола.
2.1.2 Синтез и свойства модифицированных олигонуклеотидов, содержащих пиреновый псевдонуклеозид на основе
гидроксипролинола.
2.1.3 Разработка универсального подхода к синтезу модифицирующих реагентов на основе гидроксипролинола.
2.1.4 Синтез модифицированных олигонуклеотидов. содержащих ацетиленовые группы и флуоресцентные цианиновые красители, и их использование в создании микрочипа для детекции точечных мутаций.
2.2 Синтез конъюгатов олигонуклеотидов с сольватохромным флуоресцентным красителем Нильским красным.
2.3 Синтез и свойства конъюгатов олигонуклеотидов с пиреновым бифлуорофором.
2.4 Синтез и флуоресцентные свойства олигонуклеотидов, содержащих фенилзтинилпиреновый флуорофор.
2.4.1 Флуоресцентные свойства олигонуклеотидов, содержащих фенилэтинилпиреновый флуорофор.
2.4.2 Разработка метода детекции точечных мутаций с помощью олигонуклеотидов, содержащих фенилэтинилпиреновый флуорофор.
ГЛАВА 3. Экспериментальная часть
Материалы
Методы
Выводы
Благодарности
Литература


В современных методах секвенирования ДНК флуоресцентные метки уже давно и прочно заняли ведущие позиции , . Это флуоресцентные методы секвенирования с использованием автоматических приборов, современные методы анализа на основе ПЦР, такие как ПЦР в реальном времени i . Так гибридизационный анализ на ДНКмикрочипах, микроэррэях. Флуоресцентные метки в составе конъюгатов обычно используются для детекции олиго и полинуклеотидной части конъюгатов, реже они служат источником информации о структурных изменениях в процессе различных взаимодействий. Наряду с твердофазными методами анализа на основе технологии микрочипов флуоресцентные олигонуклеотидные конъюгаты позволили осуществить с помощью ПЦРамплификации генетический анализ в растворе е добавлением специальных флуоресцентных зондов. Существуют различные варианты таких зондов . Для того, чтобы зонды меняли флуоресценцию при связывании с мишеныо, используется два способа физического воздействия на флуорофор в возбужденном состоянии резонансный перенос энергии флуоресценции и тушение. В первом случае в молекул с флурофором вводится акцептор, и такой зонд меняет спектр испускания при взаимодействии с мишенью. Если вместо акцептора присоединить тушитель, то в исходном состоянии флуоресценция зонда потушена, а при связывании с мишенью происходит разгорание, которое детектируется прямо в пробирке в процессе реакции амплификации ДНКмишени на специальном приборе. Существуют разные красители, которые применяются в качестве тушителей флуоресценции, и не обязательно их спектр поглощения должен перекрываться со спектром испускания флуорофора. В обзоре литературы собраны наиболее интересные примеры изменения эмиссионных спектров одиночных флуоресцентных красителей особое внимание уделено пирену в результате их взаимодействия с НК, а также данные о применении пар красителей, присоединенных к НК. Целью данной работы явился синтез ряда модифицирующих реагентов, получение на их основе олигонуклеотидных конъюгатов и исследование спектральных свойств полученных флуоресцентных производных олигонуклеотидов. Настоящая работа выполнена в Лаборатории химии нуклеиновых кислот Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН ИБХ РАН. ГЛАВА 1. Для синтеза олигонуклеотидов в настоящее время используется преимущественно автоматизированный фосфитный триэфирный фосфамидитный твердофазный синтез. Применение твердофазного носителя позволяет сильно упростить отделение продукта реакции от избытка реагентов. В качестве фосфорсодержащих мономеров в этом методе используются фосфамидитиые реагенты, представляющие собой диэфирмоноамиды фосфористой кислоты на основе нуклеозидов. Ключевой стадией в этом методе является реакция фосфамидитов в присутствии активатора тстразола или других близких ему по протонодонориы. Згидроксил Зконцевого нуклеотидного звена. Преимуществами фосфамидитного метода являются большая скорость синтеза и высокий общий выход Кол и гомеров . Одной из наиболее важных областей применения олигонуклеотидов является получение конъюгатов с флуоресцентными красителями. Флуорофоры являются метками прямой детекции, т. Детекция молекул флуорофоров основана на их способности к поглощению энергии фотонов с последующим излучением в виде света с иными характеристиками. Флуорофоры в настоящее время широко используются для мечения ДНКолигомеров. В связи с этим мы рассмотрим различные методы введения в олигонуклеотиды производных красителей, обладающих флуоресценцией или способных к е тушению, и их использование в биохимических и прикладных биомедицинских исследованиях нуклеиновых кислот, основанных на анализе флуоресценции или резонанасного переноса энергии. Большое число новых коммерчески доступных запатентованных амидофосфитных реагентов и носителей для модификации олигонуклеотидов можно найти в каталогах фирм , , ii. Первоначально методы получения конъюгатов олигонуклеотидметка включали в себя а олигонуклеотидный синтез, б функционализацию олигонуклеотида, в полное деблокирование, г присоединение метки, в очистку и анализ.