Структурные элементы белков rpS15e и eRF1, соседствующие с мРНК в декодирующем центре рибосомы человека

• Автор: Хайрулина, Юлия Сергеевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 128 с. : ил.

Введение
ГЛАВА X. Механизмы декодирования генетической информации на рибосомах прои эукариот на стадиях элонгации и термикации трансляции

Обзор литературы

1.1. Общие черты строения рибосом

1.2. мРНКсвязывающий центр рибосом

1.3. Декодирование мРНК на стадии элонгации

1.3.1. Роль факторов ЕРТиЕР1 А в процессе элонгации

1.3.1.1.Расположение фактора элонгации ЕРТи на рибосоме

1.3.1.2. Механизмы стимуляции ОТРазной активности ЕРТи

1.3.2. Кинетические аспекты процесса декодирования мРНК на стадии

элонгации
1.3.3. Структурные основы декодирования генетической информации на рибосомах прокариот
1.3.4. Структура декодирующего центра рибосом эукариот
1.4. Механизмы декодирования стопкодона
1.4.1. Структура и функции факторов терминации трансляции
1.4.2 Декодирование стопкодона на рибосомах прокариот
1.4.3. Декодирование стопкодона на рибосомах эукариот
1.4.3.1. Модель распознавания стопкодона фактором еЯР
1.4.3.2. Участки еИР1, вовлеченные в распознавание стопкодона
Заключение
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть
2.1. Материалы
2.2. Выделение рибосомных Б и бОБ субчастиц из плаценты человека
2.3. Введение радиоактивной метки на 5конец олигонуклеотидов и их производных
2.4. Синтез фотоактивируемых производных олигорибонуклеогидов
2.4.1. Производные, несущие перфторфенилазидогруппу на остатке гуанозина
2.4.2. Производные, несущие перфторфенилазидогруппу на остатке аденозина
или уридина, либо на Зконцсвом фосфате
2.5. Получение комплексов 5 рибосом с аналогами мРНК в отсутствие еШП
2.6. Получение комплексов Э рибосом с аналогами мРНК в присутствии сИР
2.7. Определение степени связывания меченых аналогов мРНК с 8 рибосомами
2.8. Фотоаффшшая модификация Б рибосом аналогами мРНК
2.9. Разделение модифицированных Б рибосом на субчастицы
2 Выделение Б рибосомных комплексов
2 Выделение белков, сшитых с мечеными аналогами мРНК
2 Приготовление рабочих растворов ферментов
2 Подбор условий полного гидролиза белков эндопротеазами
2 Расщепление модифицированных белков бромцианом и анализ образующихся фрагментов
2 Расщепление модифицированных белков и пептидов гидроксиламином
2 Специфическое расщепление модифицированных белков эндопротеиназами
ГЛАВА 3. Структурные элементы рибосомного белка 5 и фактора терммнации
трансляции еШЛ, соседствующие с мРНК в декодирующем центре рибосомы
человека Результаты и их обсуждение
3.1. Аналоги мРНК, использованные для аффинной модификации гр5е и еШН в составе специфических комплексов рибосом
3.2. Модельные комплексы 8 рибосом с тРНК,Ьс и аналогами мРНК, в которых проводили аффинную модификации гр5е и еШН
3.3. Выделение белков грб е и еШП, сшитых с мечеными аналогами мРНК, из облученных комплексов рибосом
3.4. Определение участков грБ е, сшивающихся с аналогами мРНК
3.5. Определение участков еЮЧ, сшивающихся с аналогами мРНК
3.5.1. Идентификация участков сшивки еШЧ во фрагменте, соответствующем полосе а, для аналогов мРНК с перфторфенилазидогруппой на остатке уридина или гуанозина
3.5.2. Идентификация участков сшивки сПН во фрагменте, соответствующем полосе а, для аналогов мРНК с перфторфенилазидогруппой на остатке адснозина или Зкопцевом фосфате
3.5.3. Идентификация участков сшивки во фрагменте еИР1, соответствующем полосе Ь, для аналогов мРНК с перфторфенилазидогруппой
на остатке уанозина
3.5.4. Идентификация участков сшивки во фрагменте еЯЛ, соответствующем полосе Ь, для аналогов мРНК с перфторфенилазидогруппой на остатке
аденозина или 3концевом фосфате
3.5.5. Участки еР, сшивающиеся с аналогами мРНК, несущими перфтрофенилазидоруппу на остатках и, в или А, либо на
3концевом фосфате
3.6. Обсуждение результатов по аффинной модификации грБ е и еЯР1 аналогами
мРНК в составе специфических комплексов Б рибосом человека
3.6.1. Сравнение результатов, по аффинной модификации грБ е в составе специфических комплексов с данными криоЭМ высокого разрешения и РСА рибосом про и эукариот
3.6.2. Структурные основы узнавания стопкодона фактором сИР на 8 рибосоме
3.6.2.1. Участки еИР1, соседствующие со стопкодоном мРНК в Аучастке рибосомы
3.6.2.2. Сопоставление данных по аффинной модификации еЯР1 аналогами мРНК с моделями терминационных комплексов 8 рибосом
Заключение
Выводы
Список литературы


В частности, в декодирующем центре рибосомы человека был обнаружен рибосомный белок , чей прокариотический гомолог , по данным РСА, удален от этого ценгра в субчастице. Однако к моменту начала настоящей работы оставалось неизвестным, какие фрагменты вовлечены в формирование декодирующего центра рибосомы человека. Метод аффинной модификации является также наиболее подходящим методом для изучения молекулярных основ декодирования стопсигнала на рибосомах высших эукариот, осуществляемого с помощью фактора терминации трансляции от англ. К настоящему времени накоплены данные об аминокислотных остатках , замена которых приводит к нарушению узнавания стоикодона 3,4. С помощью аффинной модификации удалось определить фрагмент фактора, контактирующий с первым уридином стопкодона в терминационном комплексе. Оказалось, что это высококонсервативный мотив I, расположенный в домене фактора 5. Однако данных о фрагментах , формирующих участок узнавания пуринов стопсигнала, к моменту начала настоящей работы не было. Настоящая работа является продолжением серии работ, проводимых в ЛСФРИХБФМ СО РАН, по изучению молекулярного окружения мРНК в специфических комплексах рибосом человека с помощью коротких аналогов мРНК реакционноспособных производных олигорибонуклеотидов. Целью настоящей работы являлось установление фрагментов рибосомного белка и фактора терминации трансляции , соседствующих с мРНК в декодирующем центре рибосомы человека, с помощью аффинной модификации данных белков аналогами мРНК производными олигорибонуклеотидов, несущими фотоактивируемую группу в заданном положении, в составе различных модельных комплексов рибосом с этими аналогами. Невысокий выход продуктов сшивки при аффинной модификации белков в составе таких комплексов затрудняет идентификацию модифицированных олигопептидов с помощью массспектрометрии. Этих трудностей можно избежать при использовании методологии, основанной на селективном расщеплении белка, сшитого с меченым аналогом мРНК, специфическими протеолитическими агентами. РНК, несущих перфторфенилазидобензоильную . Б рибосом. ГЛАВА 1. Рибосома уникальный рибонуклеопротеид, обладающий сложнейшей четвертичной структурой и состоящий из большой и малой субчастиц, каждая из которых содержит рРНК и несколько десятков белков. У прокариот малая и большая субчастицы имеют коэффициент седиментации и соответственно, а у эукариот и . В процессе трансляции с рибосомой взаимодействуют различные лиганды мРНК, тРНК и другие, каждый из которых имеет свой определенный участок связывания на рибосоме. На малой субчастице рибосомы расположен мРНКсвязывающий центр, а на большой субчастице находится нептидилтрансферазный центр ПТЦ, ответственный за образование пептидной связи транспептндацшо. Ключевую роль в формировании ПТЦ играет рРНК у прокариот или у эукариот для обзора см. Кроме того, на рибосоме есть три участка связывания тРНК, образованные контактными поверхностями обеих субчастиц аминоацильный тРНКсвязывающий участок Аучасток, пептидильный тРНКсвязывающий участок участок и Еучасток от англ. РНК перед выходом из рибосомы для обзора см. Процесс трансляции на рибосоме включает три стадии инициацию, элонгацию и терминацию. Инициация сложный многостадийный процесс, происходящий с участием ряда белковых факторов, который завершается образованием полноценногофункционального комплекса с инициаторной тРНК у прокариот или тРНК,Ме у эукариот в участке рибосомы, где она взаимодействует со старткодоном мРНК обычно . Элонгация начинается с синтеза первой пептидной связи и представляет собой последовательность повторяющихся событий циклов элонгации, каждый из которых приводит к удлинению полипептидной цепи на один аминокислотный остаток. Одним из ключевых моментов цикла элонгации является связывание аминоацилтРНК в участке рибосомы, где происходит декодирование генетической информации, которое заключается в том, что рибосома отбирает дтвнIIю, аминоацилтРНК, соответствующую кодону мРНК, расположенному в участке. Структурные элементы малой субчастицы рибосомы, ответственные за отбор родственной аминоацилтРНК в участке, образуют декодирующий центр.