Применение масс-спектрометрии для исследования водорастворимых полисахаридов бурых водорослей и продуктов их ферментативной трансформации

• Автор: Анастюк, Станислав Дмитриевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 117 с.

1 ВВЕДЕНИЕ.

2 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1 Современные методы массспектрометрии, применяемые для изучения олиго и полисахаридов.

2.1.1 Массспектрометрия с ионизацией электрораспылением ИЭР .

2.1.1.1 Электрораспыление как метод перевода.

ионов в газовую фазу из раствора.

2.1.1.2 История применения метода ионизации.

электрораспылением в массспектрометрии.

2.1.1.4 Электрофоретический механизм формирования заряженных капель

2.1.1.5 Модели формирования ионов газовой фазы

из малых заряженных капель

2.1.2 Массспектрометрия с матричноактивированной лазерной десорбциейионизацией МАЛДИ
2.1.2.1 Процесс образования газофазных ионов с помощью МАЛДИ
2.1.2.2 Матрицы, используемые в МАЛДИ
2.1.2.3 Подготовка пробы
2.1.2.4 Способы улучшения качества МАЛДИ анализа.
2.1.3 Применение МАЛДИ и ИЭР для анализа углеводов.
2.1.4 Тандемная массспектрометрия МСМС
2.1.5 Массспектрометричсская фрагментация молекулярных ионов олигосахаридов
2.1.5.1 Номенклатура, используемая для описания продуктов
массспектромстрической фрагментации
2.1.5.2 Фрагментация нротоннрованных молекул
2.1.5.3 Фрагментация комплексов олигосахаридов с
катионами щелочных металлов.
2.1.5.4 Фрагментация депротонированных молекул
2.2 Массснектрометрический анализ продуктов трансформации гликанов
2.2.1 МСанализ продуктов ферментативной трапсормации полисахаридов .
2.2.2 МСанализ продуктов химической деградации полисахаридов
2.3 Водорастворимые полисахариды бурых водорослей
2.3.1 Ламинаранм.
2.3.2 Фукоиданы
2.3.2.1 Фукоиданы, построенные в основном
из сульфатированной фу козы
2.3.2.2 Фукоиданы с гетерогенным моносахаридным составом.
2.3.2.3 Гетерогенность структуры фукоиданов
2.3.2.4 Методы исследования фукоиданов.
2.3.2.5 Фукоиданы и гепарин
2.4 Заключение.
3 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
3.1 Массспектрометрическнй анализ ламинаранов из бурых водорослей
3.1.1 Исследование ламнпарана из Ьаттапа ыскогшеь и продуктов его трансформации эндоР1глюканазами из различных источников
3.1.1.1 Гидролиз ламинарана изХ. сШюгюгйсх эндоР0глюканазой из АЫгикореМеп уеоеп
3.1.1.2 Трансгликозилирование, катализируемое эндоРВглюканазой из iуеюоепзк.
3.1.1.3 Гидролиз ламинарана из Ь. аскогтйез эндор0глюканазой из ЬШогта кигИа
3.1.1.4 Трансгликозилирование, катализируемое эндоГ3рПглюканазой из Ь. кигИа.
3.1.2 Исследование ламинарана из Ьаттапа урщапоуае.
3.1.3 Заключение.
3.2 Массспектрометричсский анализ фукоиданов из бурых водорослей
3.2.1 Исследование фукоидана из . v.
3.2.2 Исследование фукоидана из v
3.2.3 Исследование фукоидана из . iii.
3.2.4 Структурные характеристики фукоидана из i i.
3.2.5 Заключение.
4 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
4.1 Материалы и оборудование.
4.2 Методы
4.3.1 Получение олигосахаридов для массспектрометрического анализа.
4.3.2 Получение ламинариолигосахаридов
4.3.3 Получение ламинариолигозидов реакцией трансгликозилирования
4.3.4 Анализ поли и олигосахаридов с помощью МАЛДИ
4.3.5 Анализ олигосахаридов с помощью ИЭР
4.3.6 Анализ олигосахаридов с помощью ИЭР МСМС.
5 ВЫВОДЫ.
6 СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.
1 ВВЕДЕНИЕ
Полисахариды одни из наиболее распространенных на Земле биополимеров. Они разнообразны по составу и физикохимическим свойствам, что проявляется в многообразии их свойств и функций. Полисахариды могут выполнять структурные функции целлюлоза, глюканы клеточных стенок, функции резервных веществ амилоза, парамилои, ламинараны, водосохраняющие функции, присущие гелеобразующим полисахаридам глнкозаминогликаны и полисахариды водорослей, функции химического узнавания гликопротсинов, связанных с разными клетками.
Водорастворимые полисахариды бурых водорослей фукоиданы, ламинараны разнообразны по своей структуре и биологической активности. Фукоиданы сульфатированные гетерополисахариды проявляют иммуномодулирующее, антивирусное, противоопухолевое и антикоагулянтное действие, и в настоящее время на их основе разрабатываются биологически активные добавки и лекарственные средства. Интерес к 1 6Р0глюкаиам, к которым относятся ламинараны, связан с их влиянием на системы иммунитета растений и животных.
Несмотря на широкую известность всех этих полисахаридов, имеются трудности с установлением их структуры, которые связаны с тем, что состав и структурные характеристики полисахаридов зависят не только от вида водоросли, но и от сезона сбора, возраста и т.д. Кроме того, строение этих полисахаридов, особенно фукоиданов, отличается отсутствием регулярности и большим разнообразием.
Успешно применяемый в настоящее время подход к установлению структуры фукоиданов с помощью ЯМРспектроскопии предполагает использование химической модификации исходного полисахарида с целью упрощения его структуры. Изза высокой лабильности молекул фукоидана выходы модифицированных препаратов часто невелики, откуда следует, что значительная часть информации о структуре полисахарида, включая информацию о. минорных элементах, теряется
Современные методы, массспектрометрии позволяют получать надежные и точные результаты, благодаря аналитической гибкости, высокой, чувствительности и селективности. Использование тандемной массспектрометрии и ферментов Огликозилгидролиз, лиаз, сульфатаз с установленной специфичностью и механизмом действия позволяет устанавливать сгросиие полисахаридов с уточнением положений
минорных элементов. Ферментативная трансформация полисахаридов представляет большой интерес, так как позволяет с высоким выходом получать новые препараты с более разнообразной биологической активностью.
Целыо работы является использование методов массспектрометрии для установления структурных особенностей водорастворимых полисахаридов бурых водорослей фукоидана и лампнарана и продуктов их ферментативной трансформации, а также изучение механизма действия и специфичности ферментов, участвующих в трансформации.
В диссертационной работе представлены данные о структурных характеристиках ламинаранов и продуктов их ферментативной трансформац. Изучены каталитические свойства ферментов. Основное внимание уделено изучению структурных особенностей фукоиданов как наиболее перспективных веществ для создания БАД к пище и новых лекарственных препаратов на их основе. Разработан подход к исследованию структурных особенностей фукоиданов с помощью методов ИЭР и МАЛДИ массспектрометрии. В литературном обзоре освещены особенности современных методов массспектрометрии, применяемых для анализа гетерогенных смесей углеводов, приведена информация о механизмах массспектромстрической фрагментации, структурах и степени изученности полисахаридов бурых водорослей.
Список используемых


В диссертационной работе представлены данные о структурных характеристиках ламинаранов и продуктов их ферментативной трансформац. Изучены каталитические свойства ферментов. Основное внимание уделено изучению структурных особенностей фукоиданов как наиболее перспективных веществ для создания БАД к пище и новых лекарственных препаратов на их основе. Разработан подход к исследованию структурных особенностей фукоиданов с помощью методов ИЭР и МАЛДИ массспектрометрии. В литературном обзоре освещены особенности современных методов массспектрометрии, применяемых для анализа гетерогенных смесей углеводов, приведена информация о механизмах массспектромстрической фрагментации, структурах и степени изученности полисахаридов бурых водорослей. Автор искренне благодарит научного руководителя д. Звягинцеву Татьяну Николаевну, сотрудников лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН за помощь в работе и особенно Шевченко Н. М. за предоставленные образцы фукоиданов. Автор выражает признательность зав. Дмитренку I. Массспсктромстрия представляет собой современную фундаментальную и прикладную физикохимическую область пауки. В е задачу входит получение и накопление знаний о составе веществ, их структуре, физикохимических свойствах, а также происходящих с ними процессах. Именно эти знания позволили обеспечить и осуществить многие открытия и достижения го века, наиболее яркими из которых являются обеспечение освоения ядерной энергии, развитие микроэлектроники к ним можно добавить достижения в химии, биологии, фармакологии, открытие стабильных изотопов, фуллеренов и многое другое. Метод массспектрометрии с помощью образования ионов из нейтрального вещества, разделения их по массам и детектирования даст богатейшую информацию об окружающем мире. Массспектрометрия естественный, многосторонний и эффективный комплекс методов определения состава вещества, исследования различных ядерных, атомных, плазменных, физикохимических, биологических, геологических и технологических процессов. Она успешно дополняет, конкурирует и часто превосходит другие методы физикохимического анализа но широте и комплексности подхода, чувствительности, скорости и точности измерений. Массспсктрометрия с ионизацией элсктрораспылением начала стремительно развиваться с конца восьмидесятых годов прошлого столетия. Вместе с методом матричноактивированной лазерной десорбцииионизации МАЛДИ, этот метод открыл новые возможности для изучения высокомолекулярных соединений всех типов, включая белки, нуклеотиды, природные и синтетические полимеры. Три особенности метода ИЭР отличают его от других методов ионизации. Первая, поистине уникальная особенность метода заключается в продуцировании большого количества многократно заряженных ионов. Это свойство позволяет создавать многозарядные ионы соединений с очень большой молекулярной массой, которые можно регистрировать с помощью практически любых типов массанализаторов. Следующее отличительное свойство метода ионизации электрораспылением заключается в том, что исследуемые соединения должны вводиться в прибор в растворенном виде. Это позволяет естественным образом сочетать ИЭР МС с хроматографическими приборами, особенно с теми, которые позволяют разделять смсси высокомолекулярных соединений, например ВЭЖХ и капиллярный электрофорез. Третья уникальная особенность метода мягкость процесса ионизации электрораспылением, которая позволяет получить ионы лабильных и полярных соединений, сохранить в газовой фазе нековалентно связанные комплексы, существующие в растворе. Эта особенность также позволяет изучать третичные молекулярные конформации биополимеров. Процесс, позволяющий перевести ионы из раствора в газовую фазу, в которой они могут быть легко подвергнуты массспектрометрическому анализу, имеет огромное значение, потому что практически половина химических и биохимических реакций протекают с участием ионов, находящихся в растворах. Таким процессом является электрораспыление, позволяющее переводить ионы, существующие в различных растворах, в газовую фазу.