Особенности взаимодействия С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз с ДНК-дуплексами, содержащими аддукты 2'-дезоксигуанозина с бензо[a]пирендиолэпоксидом

• Автор: Баскунов, Владимир Борисович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 90 с. : ил.

1.1. Срвостровки, распределение неметилированных и метилированных остатков цитозина в геноме и профиль метилирования

1.2. Динамика метилирования генома

1.3. Механизм метилирования остатков цитозина в ДНК

1.4. ДПКметилтрансферазы млекопитающих

1.4.1. Семейство ОптН Каталитическая активность ОптП

1.4.2. Семейство ОппН2 Структура ОппН2 Метилирование ДНК Метилирование РНК

1.4.3. Семейство ОпшО Подсемейства ПппНЗа и ЭппиЗЬ Подсемейство ОппНЗЬ

Взаимодействие ОппиЗа, ОшгйЗЬ и ИппЗЬ с ДНК Субстратная специфичность Особенности связывания и метилирования ДНК Сконцевые домены ПппНЗа и ОппНЗЬ Взаимодействие ОпгмЗа и ИппиЗЬ с ОппнЗЬ Мутантные формы ЭппИЗа и ОппЦЗЬ Глава 2. Особенности взаимодействия С5цитозиновых ДНКметилтрансфераз с ДНК дуплексами, содержащими аддукты 2дезоксигуанозина с бензоапирендиолэпоксидом обсуждение результатов

2.1. Дизайн субстратов и их модифицированных аналогов

2.2. Взаимодействие Мбб с модифицированными субстратами

2.3. Взаимодействие Мб с ДНК, содержащей и УтрансантиЩаЬРдО

2.4. Взаимодействие М.ЕсоШ1 с ДНК, содержащей и трансантиВаРМ2Ю
2.5. Взаимодействие ЭплНЗаСИ с немодифицированными субстратами
2.6. Взаимодействие ОппиЗаСО с ДНК, содержащей и УтраисантиЩаРЛсЮ.
2.7. Связывание ОттП2 с ДНК, содержащей и УтрансантиВаРК2Ю.
2.8. Роль кофактора в устойчивости комплекса МТаз с немодифицированной ДНК
Заключение
Глава 3. Экспериментальная часть
3.1. Материалы
3.2. Приборы и методы
3.3. Общие методики
3.3.1. Выделение М.ЕсоШ
3.3.2. Выделение М.пН
3.3.3. Выделение ОттП2 и ЭппИЗаСО
3.3.4. 5Фосфорилирование олигонуклеотидов
3.3.5. Выделение олигонуклеотидов из геля
3.3.6. Разделение и диастсрсомеров олигонуклеотидов, содержащих остаток гтрансаитиВ а Р гчЮ
3.3.7. Определение концентраций активных молекул М.ЕсоШ1 по Скстчарду
3.3.8. Определение концентраций активных молекул .II, М., Оппи2 и ЭппйЗаСО с помощью поляризации флуоресценции
3.3.9. Определение Ка комплексов М.Есо1Ш с ДНК методом прямого титрования фиксированного количества ДНК различными аликвотами фермента
3.3 Определение Ка комплексов М.Есо1Ш с ДНК методом конкурентного вытеснения дуплекса из предварительно полученного комплекса с ферментом добавлением к комплексу ДНКконкурента
3.3 Определение Ка комплексов МЭбб с ДНК методом конкурентного равновесного связывания двух различных ДНК модифицированной и немодифицированной
3.3 Определение Ка комплексов ОттН2 и ОппИЗаСО с ДНК методом прямого титрования фиксированного количества ДНК различными аликвотами фермента
3.3 Метилирование ДНК в стационарных условиях
3.3 Метилирование ДНК в условиях одного оборота Выводы
Список литературы


Основными метаболитами ВаР являются диолэпоксиды и 7,8дигидрокси9,эпокси7,8,9, тетрагидробензояпирены ВяРОЕ, способные образовывать ковалентные аддукты с ДНК. Присоединение преимущественно происходит по аминогруппе гуанина с образованием и трясангшВдРс1Саддуктов. Репарация таких аддуктов в эукариотах происходит с низкой эффективностью, поэтому остатки ВдР, ковалентно присоединенные к ДНК, могут вызывать нарушение взаимодействия ферментов клеточного аппарата, в том числе МТаз, с ДНК. Большое количество повреждений, вызванных ВаРОЕ, приходится на Срвпоследоватсльности, в особенности, если остаток цитозина в них метилирован. В ранних работах показано, что статистическая обработка ВпРЭЕ эукариотических клеток приводила к снижению общего уровня метилирования генома 2. Неясными остаются молекулярные механизмы взаимодействия стсреоизомсриых ВяРЛГ2Юаддуктов с МТазами млекопитающих. МТазы млекопитающих являются малоизученными ферментами. Показано, что их первичные структуры в Сконцевой части имеют высокую степень гомологии со структурой прокариотических С5МТаз, которые изучены более подробно. МТазы могут быть использованы как модельные системы эукариотических аналогов. В качестве модельных прокариотических МТаз в настоящей работе были использованы МТазы Бээ Мбб из 5р1гор1ата и ЕсоЛН М. ЕсоШ1 из Е. И. М. Збб и М. ЕсоЯП узнают в ДНК последовательности Срв и ССтЛСО, соответственно, и метилируют в них остатки цитозина подчеркнуты по атому углерода в 5ом положении. Выбор данных МТаз продиктован их сайтспецифичностью, поскольку в эукариотах метилированные остатки цитозина обнаружены как Срв, так и в меньшей степени, в СрЛт и ССАтООпоследовагельностях. Кроме того, объектами исследования были ставшие доступными в процессе выполнения работы МТазы млекопитающих каталитический домен ЭттИЗа мыши ОпггпЗаСО и ПпггЛ2 человека. Целью настоящей работы явилось изучение влияния введения в ДНК канцерогенных и ишсдтмВдРЛбОаддуктов на функционирование С5
цитозиновых ДНКметилтрансфераз, узнающих последовательности Срв и СС А. ДНК на различные стадии каталитического цикла прокариотических МТаз Зяб и ЕсоКП и каталитического домена МТазы мыши ИппИЗа. Изучение связывания Опш с ДНКдуплексами, содержащими и трансанти В дРЛг2бО. Работа содержит обзор литературы, в котором рассмотрены механизмы функционирования ДНКметилтрансфераз млекопитающих. Глава 1. В основе современных представлений генетики лежит соответствие синтезируемых в клетке белков генетическому коду. Данное представление, однако, не объясняет отличия фенотипов дифференцированных клеток и зиготы, несмотря на идентичность их геномов. Таким образом, в геноме происходят митотически наследуемые изменения, которые нс могут быть объяснены изменением в последовательности ДНК. Описанные изменения, получившие название эпигенетических, являются объектом интенсивных исследований последних лет. Вслед за определением нуклеотидной последовательности генома человека 3 стартовала новая программа, получившая название Эпигеном человека, целью которой является идентификация расположения в ДНК метилированных по атому углерода С5 остатков цитозина 4, 5. В некоторых работах важность эпигенетических исследований подчеркивается ассоциативным обозначением 5мстилцитозина т5с1С как пятой буквы генетического кода 6, 7. В настоящее время ясно, что эукариотические МТазы вовлечены в такие клеточные процессы, как регуляция экспрессии генов, инактивация мобильных элементов и Ххромосомы, импринтинг генов и др. Нарушение метилирования приводит к возникновению и развитию некоторых заболеваний, а также канцерогенезу. Первая МТаза млекопитающих, получившая историческое название БпшП ШЛ МеИТгапБГегазе, была обнаружена в г. В г. МТазы млекопитающих ОштП2, БппйЗа и ОппПЗЬ. Свойства эукариотических МТаз, влияние метилирования ДНК на функционирование ферментов клеточного аппарата, взаимосвязь метилирования с канцерогенезом, а также методы исследования метилирования ДНК суммированы в обзорах . Настоящий обзор посвящен детальному рассмотрению молекулярных механизмов взаимодействия МТаз млекопитающих с ДНК и анализу природы метилирования ДНК на различных стадиях клеточного развития.