Действие протеолитических ферментов на вирионы вируса гриппа

• Автор: Смирнова, Юлия Александровна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 99 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

1. Структурная характеристика гемагглютинина и матриксного белка

М1 вируса гриппа ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Классификация вирусов гриппа

1.2. Структурная организация вириона вируса гриппа И

1.3. Структура поверхностного глнкопротеина гемагглютинина

1.3.1. Первичная структура. Сайт протеолигической активации

гемагглютинина

1.3.1.1. Действие трипсинподобных эндопротеаз

1.3.1.2. Действие субтилизинподобных эндопротеаз

1.3.2. Кристаллографический анализ эктодоменов гемагглютинина
1.3.2.1. Получение эктодоменов гемагглютинина протеолигической
обработкой вирионов
1.3.2.2. Пространственная структура гемагглютинина вируса гриппа А при
нейтральном
Общая характеристика
Рецепторсвязывающий сайт гемагглютинина
Антигенные сайты гемагглютинина
Пространственная структура сайта расщепления
предшественника гемагглютинина
Анализ специфичности связывания эктодоменов гемагглютинина
вируса гриппа с рецепторами клеток человека и птиц
Классификация антигенных подтипов
гемагглютинина
1.3.2.3. Перестройка гемагглютинина вируса гриппа А при
функциональноактивном
1.3.2.4. Пространственные структуры гемагтлютинина вируса гриппа В и
гемагглютининэстеразы вируса гриппа С
Гемагглютинин вируса гриппа В
Гемагглютининэстераза вируса гриппа С
1.3.3. Структурная характеристика Сконцевого фрагмента гемагглютинина. Ацилирование консервативных остатков цистеина
1.4. Структура матриксного белка М
1.5. Заключение
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
2.1. Изучение протеолиза гемагглютинина на поверхности вирионов
вируса гриппа
2.1.1. Действие различных протеолитических ферментов на вирион вируса гриппа
2.1.2. Оптимизация протокола получения субвирусных частиц при обработке вирионов бромелаином
2.1.2.1. Влияние времени проведения реакции на гидролиз гемагглютинина
2.1.2.2. Влияние соотношения ферментвирус на процесс удаления гемагглютинина
2.1.2.3. Влияние типа и концентрации восстанавливающих реагентов на гидролиз гемагглютинина
2.1.2.4. Действие бромелаина на вирионы вируса гриппа в отсутствие восстанавливающих реагентов
2.2. Изучение явления доступности мембранассоциированного белка М1 в составе вириона ограниченному протеолизу ферментами при удалении поверхностных гликонротеинов
2.2.1. Электронномикроскопический анализ вирусных препаратов
2.2.2. Влияние условий ингибирования на фрагментацию белка М
2.3. Анализ структуры заякоренного в мембрану нириона Сконцевого
сегмента гемагглютинина
2.3.1. Офаботка способов экстракции Сконцевых сегментов гемагглютинина из субвирусных частиц
2.3.2. Определение сайтов гидролиза гемагглютинина гемагглютининэстеразы в составе вирионов вирусов гриппа А, В, С протсолитичсскими ферментами
2.3.3. Изучение типа и гетерогенности ацилирования Сконцевого фрагмента гемагглютинина остатками высших жирных кислот
2.3.3.1 Гетерогенность ацилирования у вируса гриппа штамма
АРРУЖоБЮск
2.3.3.2. Ацилирование гемагглютининагемагглютининэстеразы вирусов
гриппа В и С
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. Получение очищенных препаратов вирионов вируса гриппа
3.2. Получение препаратов субвирусных частиц
3.3. Электрофоретический анализ вирусных препаратов 8электрофорез вПААГ по Лэммли
3.4. Метод хлороформметанольной экстракции разделение компонент
субвирусных частиц экстракцией по Фолчу
3.5. Массспектрометрический анализ
3.6. Электронномикроскопический анализ
3.7. Определение удельной активности бромелаина
3.8. Измерение концентрации белка в вирусных препаратах
3.9. Аминокислотный анализ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Однако, общее количество случаев заболеваемости и смертности на протяжении периодов между пандемиями на самом деле превосходит эти показатели для пандемий. Различают три типа вирусов гриппа А, В и С. Вирус гриппа типа А представляет наибольшую угрозу здоровью населения. Пандемии XX века были вызваны штаммами вируса гриппа типа А подтипов НШ1 , Н2Ы2 и НЗЫ2 1. В настоящее время, начиная с июняиюля г. Н1М1. Пандемический штамм вируса возникает намного реже эпидемических штаммов, в результате комбинирования генетического материала вируса 1риппа типа А человека с генами вирусов гриппа птиц иили млекопитающих, в результате чего образуется новый штамм, против которого у человека нет естественного иммунитета. Это приводит к началу пандемии эпидемии в мировом масштабе. При этом имеется достаточно высокая вероятность появления в ближайшем будущем новых высоко патогенных штаммов вируса. Именно высокий пандемический потенциал сделал вирус гриппа объектом углубленных исследований. Молекулярная структура оболочечных вирусов, к которым относится вирус гриппа, представляет собой яркий пример совершеннейших макромолекулярных комплексов, формирование которых достигается посредством высокой специфичности взаимодействия всех структурных компонентов вириона. НА и нейраминидазы ЫА и мембранассоциированного матриксного белка М1, образующего слой непосредственно под липидным бислоем вирусной мембраны. Это делает крайне актуальными работы, направленные на структурные исследования оболочки вириона. До настоящего времени исследование структурнофункциональных особенностей поверхностных гликобелков вируса гриппа остается одной из ключевых задач структурной вирусологии. Впервые использование вирионов вируса гриппа А как субстрата для действия протеолитического фермента бромелаина датировано годом в работе Компанса 5. Позже этот прием был использован Брандом и Скеслом 6. Целью этих авторов была последующая кристаллизация отщепляемых с поверхности вириона эктодоменов гемагглютинина. В использованных условиях протеолиза шипы нейраминидазы, повидимому, полностью разрушались. Субвирусные же частицы, т. Принимая во внимание чрезвычайную сложность структурной организации вирионов вируса гриппа, необходимо было провести более углубленное исследование последействия протеолиза на интактный вирион. Кроме того, субвирусные частицы могли быть использованы как удобная система для выделения и структурного исследования Сконцевых сегментов гемагглютинина, остающихся заякоренными в мембрану вириона после удаления эктодоменов гемагглютинина ферментом. Эти сегменты являются нетривиальной задачей для структурных исследований в силу своей гидрофобности и наличия посттрансляционных модификаций. Основной целью данной работы являлось определение возможностей протеолиза как инструмента для понимания структурнофункциональных особенностей компонентов оболочки вириона вируса гриппа. Сконцевого фрагмента малой цепи гемагглютинина и характера его посттрансляциониой модификации высшими жирными кислотами. Научная новизна н практическая значимость работы. В данной работе впервые подробно изучено действие протеолитических ферментов разных классов на интактные вирионы вируса гриппа. Показана эффективность подобного подхода для изучения особенностей структуры компонентов оболочки вириона. Сложность структурной организации данной макромолекулярной многокомпонентной биологической системы определяет сложность и многофакторность процесса протеолиза. Впервые показано, что протеолиз поверхностных гликобелков вириона приводит к нарушению целостности его мембраны и, как следствие, ограниченному протеолизу мембранассоциированного матрикспого белка М1. Изучение явления фрагментации белка М1 в составе вириона открывает возможности для изучения топографии его поверхности. Впервые протеолиз целых вирионов был использован как подход для изучения структурной организации той области гомотримерного шипа НА, которая не была закристаллизована и, следовательно, не могла быть изучена методом рентгеноструктурного анализа, а именно, области ножки шипа.