Характеристика начальных этапов функционирования системы репарации ДНК-"мисматчей" Escherichia coli с использованием модифицированных ДНК

• Автор: Перевозчикова, Светлана Анатольевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 170 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДНК-ДУПЛЕКСЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА I. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О СТРУКТУРНОФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ СИСТЕМЫ РЕПАРАЦИИ «МИСМАТЧЕЙ» В ДНК (Обзор литературы)

1.1. Роль системы MMR в биологических процессах

1.2. Общее представление о механизме и последовательности событий в процессе репарации «мисматчей» в ДНК

1.3. MutS как ключевой белок репарации «мисматчей» в ДНК

1.3.1. Структура белка MutS из Е. coli и функции его отдельных доменов..

1.3.2. Этапы действия MutS в процессе MMR

1.3.3. Роль АТФазного цикла MutS

1.4. Белок MutL - молекулярный координатор процессов репарации
«мисматчей» в ДНК
1.5. MutH - белок, направляющий действие репарации «мисматчей» в ДНК
1.6. Взаимодействие MutS, MutL, MutH и ДНК
1.7. Модели координации между участком узнавания и участком гидролиза
ДНК в системе MMR
ГЛАВА II. ХАРАКТЕРИСТИКА НАЧАЛЬНЫХ ЭТАПОВ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ СИСТЕМЫ РЕПАРАЦИИ ДНК-«МИСМАТЧЕЙ» Escherichia coli С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
МОДИФИЦИРОВАННЫХ ДНК (Обсуждение результатов)
II. 1. Характеристика влияния остатка тимидингликоля в составе ДНК на
функционирование системы MMR
II. 1.1. MutS- и MutL-зависимый гидролиз белком MutH кольцевых ДНК
с остатком тимидингликоля
И. 1.2. Термическая устойчивость 30-звенных ДНК-дуплексов, содержащих
остаток тимидингликоля
II. 1.3. Взаимодействие MutS с содержащими тимидингликоль флуоресцентно-
меченньми ДНК
И. 1.3.1. Анализ формирования изгиба тимидингликольсодержащих ДНК
при связывании с MutS
II. 1.3.2. Характеристика локализации MutS на тимидингликольсодержащих

II. 1.4. Связывание MutS с тимидингликольсодержащими ДНК-дуплексами
II. 1.5. Влияние тимидингликольсодержащих ДНК-лигандов на кинетику
гидролиза АТФ
II. 1.6. Влияние тимидингликольсодержащих ДНК-лигандов на обмен АДФ
в АТФазных доменах MutS
II.2. Ковалентная фиксация MutS для функциональных исследований
процесса репарации «мисматчей» в ДНК
11.2.1. Дизайн и получение мутантных форм белка MutS, содержащих единичный
остаток цистеина
И.2.2. Характеристика мутантных форм белка MutS с единичным
остатком цистеина

II.2.3. Взаимодействие ДНК-дуплексов, содержащих 2'-йодацетамидную группировку, с ДНК-связывающими белками
11.2.3.1. Взаимодействие с сайт-специфической никазой BspD
11.2.3.2. Взаимодействие с мутантными формами MutS
И.2.4. Ковалентное связывание MutS с фрагментами ДНК, содержащими
дисульфидную группировку
11.2.4.1. Взаимодействие мутантных форм MutS с ДНК-дуплексами с 2'-пиридилдисульфидной группировкой
11.2.4.1.1. Синтез олигонуклеотидов, содержащих
2'-дезокси-2'-[3-(2-пиридилдитио)пропионамидо]уридиновое звено
11.2.4.1.2. Ковалентное связывание мутантных форм MutS с
2'-пиридилдисульфидными производными ДНК-дуплексов
11.2.4.2. Взаимодействие ДНК-дуплексов с З'-концевой дисульфидной группировкой с мутантными формами MutS
11.2.5. Конструирование модифицированных ДНК для исследований особенностей функционирования системы MMR
11.2.6. Разработка методов выделения конъюгатов MutS с ДНК
11.2.6.1. Выделение конъюгатов MutS с ДНК методом эксклюзионной ВЭЖХ
11.2.6.2. Выделение конъюгатов MutS с ДНК методом аффинной
хроматографии
11.2.7. Анализ функциональной активности белка MutS в составе конъюгатов
с ДНК
11.2.7.1. Эффективность обмена АДФ в MutS, зафиксированном на ДНК
11.2.7.2. Формирование «тройного» комплекса ДНК/MutS/MutL
И.2.8. Структурно-функциональные исследования MMR с использованием
конъюгатов MutS с ДНК
11.2.8.1. Конформационные перестройки ДНК при образовании «окончательного» узнающего комплекса
11.2.8.2. Выяснение возможности активации MutH в присутствии MutS, зафиксированного на ДНК в области «мисматча»
11.2.8.2.1. «Мисматч»-зависимый гидролиз линейных ДНК-дуплексов
в присутствии белков MutS, MutL и MutH
11.2.8.2.2. «Мисматч»-зависимая активация MutH в присутствии MutL
и MutS(A469C), зафиксированного на ДНК
ГЛАВА III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
III. 1. Реактивы и материалы
111.2. Приборы и методы
111.2.1. Электрофоретические методы
111.2.1.1. Горизонтальный электрофорез в 1%-ном агарозном геле
111.2.1.2. Вертикальный электрофорез в 15-20%-ных ПААГ
111.2.1.3. Вертикальный электрофорез в 4%-ных и 8%-ных ПААГ
111.2.1.4. Вертикальный электрофорез в 20-30%-ных ПААГ с 7 М мочевиной
111.2.1.5. Электрофорез по Лэммли
111.3. Общие методики
111.3.1. Трансформация компетентных клеток Е. coli
III.3.1.1. Метод «теплового шока»
III .3.1.2. Метод электропорации
III.3.2. Экспрессия рекомбинантных белков MutS, MutL и MutH в
клетках E. coli
111.3.3. Выделение и очистка рекомбинантных белков MutS, MutL и MutH
111.3.4. Выделение плазмидных ДНК
111.3.5. Конструирование модифицированных кольцевых ДНК-субстратов
111.3.6. Конструирование флуоресцентно- и 32Р-меченных ДНК-дуплексов
111.3.7. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов с йодацетамидной
группировкой в 2'-положении углеводного фрагмента
111.3.8. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов с единичным 2'-дисульфидсодержагцим уридиновым звеном
111.3.9. Определение термической устойчивости ДНК-дуплексов
111.3.10. Активация начальных этапов репарации «мисматчей» в ДНК
111.3.11. Связывание сайт-специфической никазы BspD6I с ДНК-лигандами
111.3.12. Гидролиз 32Р-меченной ДНК сайт-специфической никазой BspD
111.3.13. Связывание белка MutS с ДНК-лигандами
111.3.14. Ковалентное связывание белка MutS с реакционноспособными ДНК-лигандами
111.3.14.1 Взаимодействие ДНК-дуплексов, содержащих остаток
2'-дезокси- 2'-йодацетамидоуридина, с мутантными формами MutS
111.3.14.2 Взаимодействие ДНК-дуплексов, содержащих дисульфидную группировку, с мутантными формами MutS
111.3.15. Выделение ДНК-белковых конъюгатов методом хроматографии
111.3.15.1. Эксклюзионная ВЭЖХ
111.3.15.1. Аффинная хроматография
111.3.16. Флуоресцентные методы
111.3.17. Кинетика гидролиза АТФ белком MutS
111.3.18. Кинетика обмена АДФ в АТФазных доменах белка MutS
111.3.19. Образование «тройного» комплекса линейной ДНК с белками
MutS и MutL
111.3.20. Активация гидролиза ферментом MutH линейных
ДНК белками MutS и MutL
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Важной чертой MutH является увеличение его каталитической активности в процессе MMR. До сегодняшнего дня неясно, каким образом происходит стимуляция активности MutH. В кристаллической структуре апоформы белка MutH ДНК-связывающий канал не достаточно широк для связывания ДНК. Предполагается, что при связывании MutL с MutH, происходит расширение ДНК-связывающего канала последнего, что увеличивает скорость связывания MutH с ДНК [145]. Как показали эксперименты по белок-белковым сшивкам, MutL взаимодействует с расположенной на поверхности глобулы MutH длинной а-спиралью Е (обозначена на рис. 1.9) [146]. Возможно, образование белок-белковых контактов облегчает вращательное движение С-«руки» MutH, в результате чего ДНК-связывающий карман оказывается более доступным для связывания с субстратом [139, 146].
1.6. Взаимодействие MutS, MutL, MutH и ДНК
Как упоминалось ранее, «тройной» комплекс, состоящий из белков MutS и MutL, связанных с ДНК, является ключевым интермедиатом в репарации «мисматчей» в ДНК. Он координирует все этапы репарации после узнавания «мисматча» (т. е. эксцизионную репарацию, включая расплетание ДНК по направлению к «мисматчу») и также вовлечён в передачу сигнала о наличии повреждения в ДНК другим системам клетки, контролирующим клеточное деление и запуск апоптоза [147]. Однако структура этого комплекса на сегодняшний день не выяснена. Кроме того, сам белок MutL имеет довольно низкое сродство к ДНК, особенно к коротким линейным фрагментам ДНК. В присутствии MutS, ионов Mg2+ и АТФ связывание с ДНК происходит более эффективно [124, 89].
Исследование «тройного» комплекса (MutS, MutL и ДНК) ввиду его динамичной природы невозможно методом РСА. Поэтому для выяснения областей контакта MutS и MutL использовали анализ мутантных форм белков и метод масс-спектрометрии, основанный на водород/дейтериевом обмене. Благодаря этим исследованиям было выяснено, что аминокислоты MutS, важные для образования контактов с MutL, расположены в его соединительном домене [148]. N-концевые, АТФазные домены MutL принимают участие во взаимодействии с MutS [139]. Кроме того, проводились детальные исследования, основанные на сайт-направленной белок-белковой «сшивке» с помощью бифункциональных химических агентов, реагирующих с остатками цистеина белка, в сочетании с флуоресцентными методами [149]. Предварительно были сконструированы мутантные формы белков MutS и MutL, содержащие единственный остаток цистеина в заданном положении молекулы белка. На основе экспериментальных данных Винклер и соавт. [149] была предложена модель структуры комплекса MutS и MutL, связанных с ДНК, содержащей «мисматч». Авторы для