Генетический и биохимический анализ сборки РНК-полимеразы

• Автор: Нарышкина, Татьяна Николаевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 104 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

1. ДНКЗАВИСИМЫЕ РНКПОЛИМЕРАЗЫ СТРУКТУРА И МЕЖСУБЪЕДИНИЧНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ОБЗОР

ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общие сведения о транскрипционном цикле

1.1.1. Инициация транскрипции

1.1.2. Элонгация транскрипции.

1.1.3. Терминация транскрипции

1.2. Кристаллические структуры многосубъединичных РНКполимераз

1.2.1. Кристаллическая структура РНКполимеразы II vii.

1.2.2. Кристаллическая структура РНКполимеразы i
1.2.3. Кристаллическая структура РНКполимеразы .i
1.3. Сравнение кристаллических структур многосубъединичных РНКполимераз
1.4. Взаимодействия между а и рсубъединицами
РНКполимеразы .i
1.4.1. Структура, доменная организация и функции асубъединицы РНКполимеразы .i
1.4.2. Структура, доменная организация и функции субъединицы РНКполимеразы .i
1.5. Краткое описание метода двухгибридного анализа
2. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ И БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СБОРКИ РНКПОЛИМЕРАЗЫ ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
2.1. Определение взаимодействий между а и рсубъединицами РНКполимеразы .i двухгибридным методом
2.2. Определение минимального фрагмента рсубъединицы РНКполимеразы .i, взаимодействующего с асубъединицей.
2.3. Определение консервативных районов субъединицы РНКполимеразы .i, взаимодействующих друг с другом, двухгибридным методом анализа
2.4. Структурный анализ результатов двухгибридного метода по
и взаимодействиям
2.5. Точечные мутации в консервативных районах Н и I субъединицы РНКполимеразы .i, влияющие на
связывание с субъединицей i viv и i vi.
2.6. Эволюционный консерватизм взаимодействия между
гомологами а и субъединиц РНКполимераз.
2.7. Определение минимального субкомплекса РНКполимеразы .i, содержащего функционально активный сайт связывания инициирующего нуклеотида.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Относительная простота орг анизации транскрипционного аппарата и лгкость выделения прокариотических РНКполимераз определили их роль модельных систем при изучении транскрипции. Индивидуальные субъединицы РНКполимеразы не обладают парциальными функциями целого фермента 9. Следовательно, функциональные сайты фермента формируются либо аллостерически при сборке белка, либо в районах контактов нескольких субъединиц. РНКполимеразы. Настоящая работа посвящена изучению взаимодействий между а и субъединицами РНКполимеразы ii i и РНКполимераз 1 и III дрожжей vii с применением молекулярногенетических и биохимических методов. Цель работы и задачи исследования. Целью данной работы явилось установление структурных детерминант а и субъединиц РНКполимеразы . В работе ставились следующие задачи 1 определение наименьшего фрагмента субъединицы, взаимодействующею с асубъсдиницей в составе окомплекса 2 получение точечных мутаций в а и в субъединицах, нарушающих взаимодействие 3 определение участков внутри субъединицы, которые взаимодействуют друг с другом и имеют важное значение при сборке интермедиата 2 4 установление эволюционного консерватизма во взаимодействиях а и субъединиц прокариотических и эукариотических РНКполимераз 5 изучение взаимодействия индивидуальной субъединицы и агЗкомплекса РНКполимеразы . Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые показано, что наименьшим фрагментом субъединицы РНКполимеразы . Установлено, что существует необходимое для связывания с асубьединицей взаимодействие между консервативными районами и I субъединицы РНКполимеразы . Определены детерминанты в субьсдинице РНКполимеразы . Впервые показан эволюционный консерватизм взаимодействия между гомологами а и субъединиц эукариотических и прокариотических РНКполимераз. Установлено, что пуринспецифичный инициаторный сайт фермента сайг инициации транскрипции полностью сформирован в индивидуальной субъединице и в окомплексс РНКполимеразы . РНКполимераз с использованием метода двухгибридного анализа. Полученные в работе данные важны для понимания структурного и эволюционного аспектов белокбелковых взаимодействий в составе многосубъединичных ферментов. Струюура и объм работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения полученных результатов и их обсуждения, материалов и методов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 4 страницах машинописного текста и содержит рисунков и 6 таблиц. Библиография содержит 5 публикаций. Настоящий обзор посвящн анализу кристаллических структур РНКполимсраз i, ii i и РНКполимеразы II дрожжей vii и имеющимся данным по взаимодействиям между отдельными субъединицами, в частности между а и субъединицами РНКполимеразы . В обзоре также кратко рассмотрены современные представления о стадиях транскрипционного цикла и кратко описаны основы двухгибридного анализа, используемого в данной работе. Процесс синтеза РНК на матрице ДНК, называемый транскрипцией, к настоящему времени изучен в деталях. Транскрипция осуществляется особым классом ферментов ДНКзависимыми РНКполимеразами. Многосубъсдиничные РНКполимеразы всех живых организмов от бактерий до человека структурно и функционально гомологичны. Бактериальные РНКполимеразынаиболее простые и изученные представители этой группы ферментовявляются удобной моделью для изучения транскрипции. Корфсрмснт прокариотической РНКполимеразы полностью каталитически компетентен. Он обладает способностью к сиквенснсспсцифичсской инициации транскрипции, способностью к элонгации транскрипции и способностью к терминации транскрипции, но не способен к локализованной инициации транскрипции с промоторных участков ДНК. Взаимодействие корфермента РНКполимеразы с одним из нескольких инициаторных стфакторов приводит к образованию голофермента, способного к специфической инициации транскрипции па промоторах. Транскрипционный цикл разделяют на три стадии инициации, элонгации и терминации I0. Стадии транскрипционного цикла на примере прокариотической РНКполимеразы можно представить в следующем виде рис.