Синтез и свойства химерных мембрано-активных пептидов на основе грамицидина А

• Автор: Стоилова, Татьяна Борисовна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 114 с. : ил.

Содержание

Список сокращений

Введение

Часть I. Литературный обзор

Глава 1. Грамицидин А

1.1 Биосинтез и биологическая роль грамицидина А

1.2 Пространственная структура грамицидина А

1.2.1 Многообразие структур грамицидина А в растворах

1.2.2 Структура грамицидина А в фосфолипидной мембране

1.3 Ионофорные свойства грамицидина А

1.4 Применение грамицидина А в качестве антибиотика

Глава 2. Пептиды, способные пересекать плазматическую мембрану
2.1 Краткая характеристика основных известных СРР
2.1.1 НГУ1 Та
2.1.2 Пенетратин
2.1.3 НБУФ
2.1.4 Транспор ган 2
2.1.5 Поликатионныс пептиды и другие СРР
2.1.6 Антимикробные пептиды
2.2 Перспективы практического использования СРР
2.2.1 Лечение онкологических заболеваний
2.2.2 Лечение сердечнососудистых заболеваний
2.3 Механизм проникновения пептидов в клетку
Часть II. Результаты и обсуждения.
Глава 3. Синтез химерных пептидов
Г лава 4. Ионофорные свойства химерных пептидов.
4.1 Образование одиночных каналов
4.2 Макроскопический ток через мембрану
4.3 Исследование свойств ионных каналов, образованных пептидами Р4С и РС, методом фотодинамической инактивации
Гла в а 5. Взаимодействие флуоресцентного производного пептида Р1 ОС с мембранами клеток
Глава 6. Доставка белков в клетки с помощью химерных пептидов
6.1 Трансдукция ргалактозидазы
6.2 Трансдукция пероксидазы хрена
6.3 Трансдукция флуоресцентных белков
Глава 7. Образование комплексов с белками
7.1 Метод электрофореза в полиакриламидном геле в неденатурирующих
условиях
7.2 Изменение ферментативной активности Ргалактозидазы
Глава 8. Цигготоксическое действие химерных пептидов
Гл а в а 9. Материалы и методы
9.1 Материалы
9.2 Методы
9.2.1. Синтез пептидов
9.2.2. Ионная проводимость бислойных мембран
9.2.3 Клетки и клеточные культуры
9.2.4. Трансдукция белков
9.2.5. Взаимодействие РСИи с клеточной мембраной
9.2.6 ЦитотоксическиЙ эффект
9.2.7 Связывание пептидов с белками
Выводы
Литература


При этом полагают, что гидрофобная последовательность обладает не только способностью взаимодействовать с мембраной, но также может принимать участие в процессе образования комплексов с белком за счет гидрофобных взаимодействий. В связи с вышесказанным, актуальной задачей является оптимизация векторов для внутриклеточной доставки белков в составе нековалентных комплексов, направленная на повышение эффективности переноса и снижения токсичности для клетокмишеней. Целыо данной работы являлся синтез и исследование свойств серии пептидов на основе грамицидина А и сигнала ядерпой локализации вируса обезьян 8У. Кроме того, предполагалось исследовать каналообразующие свойства полученных производных на модельных липидных бислоях. Таким образом, первой задачей данной работы являлся синтез серии химерных пептидов. Грамицидиновая последовательность была выбрана в качестве гидрофобного домена в силу ее высокого сродства к мембране. Кроме того, предполагалось, участие грамицидинового фрагмента в образовании нековалентных комплексов с белками засчет гидрофобных взаимодействий 1. Вторым компонентом полученных производных был положительно заряженный пептидный сегмент с аминокислотной последовательностью сигнала ядерной локализации вируса V V, присоединенный как но , так и по Оконцу. Высокое содержание основных аминокислот в составе V предположительно способствует первоначальному взапмдоействию пептида с клеточной мембраной и накоплению его на поверхности бислоя, что ранее было показано как для антимикробного пептида меллитина, так и для пептидов, способных проникать в клегку i i, СРР, пенетратина и Рер1 13. Кроме того, не исключено участие положительно заряженной последовательности в процессе комплсксообразования с белками за счет ионных взаимодействий. Наряду с катионными производными был полущен анионный аналог, а также производные с модифицированным концом последовательности грамицидина Л с целью изучения влияния подобных изменений на способность транспортировать белки в клетку. Для изучения взаимодействия пептида с клеточной мембраной был синтезирован флуоресцснтномеченный положительно заряженный аналог. В заключительной части была изучена способность полученных аналогов транспортировать функционально активные белки через клеточную мембрану. В качестве модельных белков были использованы как флуоресцентные , родаминмеченный , так и белки, обладающие ферментативной активностью ргалактозидаза, пероксидаза. На основе количественной оценки трансдукции ргалактозидазы из всего ряда производных грамицидина А был выбран один из наиболее активных аналогов РС и проведено его сравнение с известным из литературных данных пептидом Рер1. Был также исследован токсический эффект, оказываемый на клетки несколькими химерными пептидами и показано, что РС нетоксичен в интервале концентраций, применяемых для трансмембранного переноса белков. Для наиболее активных аналогов было исследовано также взаимодействие пептидбелок, приводящее к комплексообразованшо. Глава 1. Грамицидин А это линейный пентадскапептид, продуцируемый бактериями i vi. Впервые грамицидин А был получен в г. Дюбо в составе антибиотического комплекса, названного грамицидином. Первичная структура пептида, отличительной особенностью которой является чередование и аминокислот, была расшифрована в г. В состав грамицидина входит семейство близко родственных пептидов, различающихся по одной аминокислоте в положении и представленных в соотношении 5 соответственно рис. Природные образцы грамицидинов содержат около гомологов, в которых концевой остаток валина замещен изолейцином 4. Грамицидин iV4ViVVi,V4. Грамицидин В V. Рисунок 1. Аминокислотная последовательность пептидов, входящих в состав природного грамицидина . Грамицидины практически нерастворимы в воде 1 мгл, малорастворимы в углеводородах, но хорошо растворяются в органических растворителях, таких как спирты, альдегиды, кстоны, , , кислоты, диоксан. В естественных продуцентах грамицидины синтезируются по иернбосомалыюму пути, причем за синтез нерибосомальных пептидных синтстаз, участвующих в образовании грамицидина, отвечают 4 крупные открытые рамки считывания , , и , состоящие из 2, 4, 6 и 4 модулей соответственно.