Цитолитические и антимикробные пептиды из яда паука Lachesana tarabaevi

• Автор: Василевский, Александр Александрович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 101 с. : ил.

Оглавление
1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Мембраноактивные пептиды

2.2. Цитолитические, антимикробные и защитные пептиды

2.3. Многообразие цитолитических и антимикробных пептидов

2.4. Биосинтез цитолитических и антимикробных пептидов

2.5. Механизм действия цитолитических и антимикробных пептидов

2.6. Состав ядов членистоногих

2.7. Цитоли гические и антимикробные пептиды из ядов членистоногих

своеобразие и многообразие

2.7.1. Место цитолитических и антимикробных пептидов из ядов
в общей системе
2.7.2. Классификация цитолитических и антимикробных пептидов
из ядов членистоногих
2.8. Цитолитические и антимикробные пептиды из ядов пауков
2.9. Цитолитические и антимикробные пептиды из ядов
членистоногих биологическая функция
2 Заключение
3. Материалы и методы исследования
3.1. Материалы
3.2. Разделение яда. Очистка пептидов
3.2.1. Гельфильтрация
3.2.2. Обращеннофазовая высокоэффективная жидкостная хроматография
3.3. Массспектрометрия
3.4. Восстановление дисульфидных связей и алкилирование тиольных групп
3.5. Определение Аконцевой аминокислотной последовательности
3.5.1. Автоматическое ссквенирование по Эдману
3.5.2. Отщепление Мконцевого остатка пироглутаминовой кислоты
3.6. Селективный гидролиз полипептидов
3.6.1. Расщепление полипептидов бромцианом
3.6.2. Ферментативный гидролиз полипептидов
3.7. Химический синтез пептидов
3.8. Определение концентрации полипептидов. УФспектрофоюметрия
3.9. Приготовление липосом
3 Круговой дихроизм
3 Тестирование антимикробной активности
3 Тестирование цитолитической активности
. Тестирование гемолитической активности
. Токсичность в отношении лейкоцитов человека и клеток насекомых 9
3 Анализ токсичности на животных
. Анализ инсектицидной активности
. Анализ токсичности для млекопитающих
3 Бислойные липидные мембраны
3 Действие пептидов на липосомы
3 Получение рекомбинантных пептидов
. Получение бактериальных экспрессирующих векторов,
кодирующих целевые пептиды
.1. Синтез генов, кодирующих целевые пептиды
.2. Полимеразная цепная реакция
.3. Осаждение и очистка ДНК
.4. Рестрикция линейных фрагментов ДНК и плазмиды рЕТЬ
.5. Электрофорез ДИК в агарозном геле
.6. Лигирование линейных фрагментов ДНК и плазмиды рЕТЬ
.7. Трансформация . i методом электропорации
.8. Отбор трансформантов, содержащих интересующую последовательность ДНК
.9. Выделение плазмидной ДНК
. Получение гибридного белка
.1. Контролируемая экспрессия гена гибридного белка
.2. Выделение растворимой фракции белков . i
.3. Аффинная хроматография
. Гидролиз гибридных белков и очистка рекомбинантных пептидов
. Электрофорез белков в полиакриламидном геле
4. Результаты исследования и обсуждение
4.1. Выделение активных молекул
4.2. Установление первичной структуры новых пептидов
4.3. Анализ первичной и вторичной структуры новых пептидов
4.4. Характеристика функциональных свойств выделенных веществ
4.5. итои нее ктотоксины новый класс компонентов яда пауков
4.6. Структура предшественников и схема биосинтеза новых пептидов
4.7. Функциональная значимость посттрансляционных модификаций
4.8. Получение латарцина 2а в . i
4.9. Функция пропоследовательности предшественников ЦП и АМП
4 Уникальный молекулярный состав яда . vi
4 Биомолекулярное разнообразие цитолитических компонентов яда
5. Выводы
6. Список сокращений
7. Благодарности
8. Список литературы
Введение


Несмотря на существование более сильных антибиотиков, действующих при меньших концентрациях, АМН обладают рядом преимуществ. Способность быстро убивать клеткимишени, широкий спектр действия, активность в отношении штаммов, резистентных к другим антибиотикам, а также относительная трудность в селекции устойчивых мутантов i vi, позволяют рассматривать эти вещества в качестве основы для создания эффективных лекарств, особенно на фоне снижения потенциала обычных антибиотиков . Учитывая широкое разнообразие ЦП из яда членистоногих, проявляющих различные спектры действия, предполагается возможным их использование как лекарственных прототипов. Ущерб, наносимый мировому сельскому хозяйству со стороны патогенов культурных растений грибов, бактерий, вирусов и вироидов и насекомыхвредителей две главные причины ущерба, оценивается трлн. Потери нередко достигают урожая. Современные методы, применяемые с целью снижения убытков, в основном сводятся к использованию синтетических пестицидов, многие из которых являются экологически агрессивными веществами. Использование химических средств защиты растений представляет значительную опасность для окружающей среды, биологические средства защиты растений являются более безопасными. Внедрение инсектицидов нового поколения позволило улучшить ситуацию лишь на 5 . Пионерские работы по получению резистентных сортов сельскохозяйственных культур с использованием технологий рекомбинантных ДНК были выполнены около лег назад , . С использованием гена инсектицидного белка бактерии i iii были получены трансгенные растения табака, устойчивые по отношению к паразитическим личинкам бабочки x. С тех пор, но крайней мере, генов эн гомотоксинов из В. Значительная часть мирового урожая приходится сегодня на долю трансформированных продуктов информация взята е официального сайта Департамента сельского хозяйства США . Тем не менее, до сих пор не решен вопрос о безопасности содержащих продуктов для человека, не совсем ясны экологические последствия глобального распространения трансгенных растений, содержащих гены эн гомотоксинов В. Кроме того, видимое нарушение межвидового барьера получает отрицательный отклик в современном обществе. На рынке практически не представлены другие генмодифицированные сорта с повышенной устойчивостью. Более того, инженерия устойчивости к заболеваниям оказалась более сложной задачей, нежели повышение сопротивляемости насекомым. Согласно современным представлениям, ЦП и АМП представляют собой перспективный инструмент инженерии устойчивости растений к патогенам и могут быть использованы в зеленой биотехнологии. В качестве объекта исследования был выбран яд среднеазиатского паука vi i viiv, из семейства ii паукимуравьеды. Яд этого паука обладает наиболее выраженным питолитическим действием в отношении различных клеток среди ядов около ста различных видов членистоногих из семейств, имеющихся в коллекции лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов ИБХ РАН. Цельный яд обладает также высокой антимикробной активностью в отношении ii i со значением минимальной ингибирующей концентрации МИК мкгмл и высокой инсектицидной активностью против личинок серой мясной мухи i со значением средней летальной дозы ЛД при инъекции 3 мкгг характер симптомов, вызываемых введением яда некроз близлежащих тканей, обильное выделение жидкости, указывал на наличие в его составе цитолитических агентов . Мы предположили, что яд ,. ЦП и АМП. Цель настоящей работы состояла в изучении цитолитичсских и антимикробных пептидов ЦП и АМН из яда среднеазиатского паука vi. Разработать систему гетерологичной экспрессии генов новых пептидов. Для изучения ЦП и АМП из яда . Первая и более традиционная заключалась в выделении из яда индивидуальных активных соединений и установлении их аминокислотной последовательности. Вторая предусматривала анализ i ii транслированных нуклеотидных последовательностей из библиотеки кДНК ядовитых желез паука, имеющейся в лаборатории, и выявление потенциальных МАП. Сравнение двух групп данных позволило получить наиболее полную информацию о МАП яда.