Структурно-функциональная организация ионтранспортирующих мембранных белков

• Автор: Шахпаронов, Михаил Иванович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 200 с.

Введение

1. Литературный обзор

1.1. Са2ЛТФаза плазматических мембран

1.1.1. Очистка и реконструкция

1.1.2. Общая функциональная характеристика

1.1.3. Топология молекулы

1.1.4. Регуляция активности кальмодулином

1.1.5. Другие модуляторы активности

1.1.6. Разнообразие изоформ

1.1.7. Системы экспрессии

1.1.8. Медицинские аспекты

1.2. Семейство XiАТФаз
1.2.1. ,1САТФаза
1.2.2. Желудочная НКАТФаза
1.2.3. Рсубъединицы ХКАТФаз
1.2.4. НКГАТФаза нежелудочного типа
1.2.4.1. Идентификация мРНК и гена
1.2.4.2. Проблема классификации
1.2.4.3. Вопрос о истинной Рсубъединице
1.2.4.4. Каталитические свойства
1.2.4.5. Тканеспецифичность экспрессии и внутриклеточная локализация
1.2.4.6. Физиологическая роль
1.3. Н трансгидрогеназа
2. Результаты и их обсуждение
2.1. СагАТФаза плазматических мембран
2.1.1. Картирование регуляторных участков
2.1.2. Получение
2.1.3. Тонкое картирование эпитопов
2.1.4. Мембранная топология молекулы
2.2. Нтрансгидрогеназа
2.2.1. Разработка нового метода очистки
2.2.2. Изучение структурнофункциональной организации
2.3. НКАТФаза нежелудочного типа
2.3.1. Получение специфических антител к асубъединице
2.3.2. Исследование ткакеспецифичности экспрессии гена АТР
2.4. Каталитическая субъединица ,КАТФазы
2.4. . Проблема трансмембранной топологии Сконцевон половины 2.4.2. Получение библиотеки антител, специфичных к участкам асубъединицы
XАТФазы
2.4.3. Изучение трансмембранной организации Ка,КАТФазы
2.5. Мышечная Рсубъединица ХКАТФаз
3. Экспериментальная часть
4. Выводы
5. Благодарности
6. Список сокращений
7. Список литературы
ВВЕДЕНИЕ


В консервативном третьем, большом цитоплазматическом домене различают сайт фосфорилирования, сайт связывания АТФ способен модифицироваться ФИТЦ и гипотетический шарнирный регион, необходимый для схождения сайтов связывания АТФ и фосфорилирования. Сконцевой домен, имеющий высоко и низкоконсервативные участки будет удостоин особого рассмотрения в следующем разделе. Здесь только будет уместным отметить, что для него показано наличие связывания трех ионов кальция . В то же время местонахождение сайта связывания Са2, реально необходимого для транспорта, до сих пор не установлено. Определение трехмерной структуры РМСА представляется недостижимым в обозримом будущем изза общих трудностей кристаллизации мембранных белков, хотя попытки кристаллизации РМСА уже предпринимались . Сравнительно низкая доступность РМСА заставляет думать, что трехмерная структура других АТФаз, например БЕРСА, будет установлена раньше. Действительно, для БЕРСА методом электронной микроскопии двумерных кристаллов уже получено примерное изображение молекулы. Хотя и с очень низким разрешением, но довольно похожее изображение РМСА получено при помощи атомносиловой микроскопии . Точная аналогия РМСА и БЕРСА вряд ли уместна изза наличия у РМСА дополнительных участков, однако можно обоснованно предполагать, что все же РМСА имеет компактную мембранную, небольшую внеклеточную и большую, сильно вытянутую внутриклеточную части. Проблемы топологии РМСА будут рассмотрены также в разделе Результаты. Что сделано для тестирования предсказанной трансмембранной топологии РМСА Наибольший прогресс достигнут благодаря применению моноклональных антител МА. Так, Адамо с ссавт. МА при помощи ИФА делеционных мутантов РМСА с точностью 0 а. Изучение связывания меченых антител с препаратами инвертированных и правильноориентированных мембранных пузырьков эритроцитов, позволило сделать вывод, что предсказанная модель укладки РМСА в основном верна. Результаты топологических экспериментов с применением МА показаны в Табл. Подавляющее количество МА реагируют с внутренней стороны РМСА. Только одно антитело реагирует с наружной стороны, однако его эпитоп имеет интегральную природу, поэтому авторам не удалось произвести его точное картирование с использованием коротких фрагментов. МА , 1Е4 эпитоп был очень точно локализован при помощи анализа аминокислотных последовательностей протеолитических фрагментов РМСА, реагирующих с МА. Ориентацию этого эпитопа в нативном ферменте определяли по связыванию меченых антител с интактными клетками и инвертированными мембранными пузырьками . Эта работа получилась очень интересной, в частности, удалось показать изоформспецифичность антитела и локализовать его эпитоп достаточно узко Е0Е2 для ИРМСА1. Итак, благодаря этим исследованиям теоретически предложенная модель укладки полипептидной цепи Са2АТРазы подтверждена для участка , в то время как топография участка 3 остается малоисследованной. Соблазнительной казалась идея использования гидрофобных фотоактивируемых меток. РЕТРЭ РМСА совместно с РЕТРЭ реконструировали в липосомы и облучали светом, а затем подвергали протеолизу трипсином или протеазой 8 . Полученные фрагменты идентифицировали при помощи иммуноблоттинга основные трипсиновые , , и . Да и основные фрагменты 8 , , и кДа. Был сделан вывод о существовании в молекуле РМСА трех гидрофобных кластеров. В целом это соответствует предсказанной топологии, но не может указать на какиелибо тонкие структрурные черты, особенно в длинном гидрофобном регионе. Делеция го, последнего, трансмембранного столба не приводит к изменению топологии, Сконец остается внутри клетки. Такой мутант не имеет АТФазной активности, но способен образовать ацилфосфат , поэтому вполне вероятно, что Сконцевой домен и й траенмембранный столб возможно и 9й не влияют на фолдинг остальной части молекулы. Антитела и протеазы можно использовать и для тестирования поверхностьэкспонированных участков, их роли в функционировании фермента. Полученные первыми антиРМСА поликлональные кроличьи антитела ингибировали активность и транспорт РМСА, но не БЕРСА и не рКАТРазы. МА 2ВЗ 0 ингибирует РМСА за счет конкуренции с АТФ к сожалению, эпитоп этого МА не был локализован.