Структурно-функциональный анализ нового белка хампина как компонента ядерного интерактома

• Автор: Дмитриев, Руслан Игоревич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 112 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ЭВОЛЮЦИЯ БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ, ИМЕЮЩИХ В СВОЕМ СОСТАВЕ АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗУ ГИСТОНОВ I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Предисловие

Структура и функция компенсасомы комплекса, включающего в себя белки 1 и

у i

Основные компоненты компенсасомы

Дополнительные компоненты комплекса

Механизм работы компенсасомы

Комплекс у других организмов

Другие комплексы с участием хампина 1 и ацстилтрансферазы 1
Ацетилтрансферазы и апоптоз
Эволюционные аспекты, связанные с функционированием комплексов на основе
ацетилтрансфераз 1
Современные представления о механизме функционирования хроматина согласно
парадигме сканирования хроматина
Подвижность белков в ядре
Флуктуации доступности нуклеосом
Открытые состояния, случайное связывание и общая схема ядерных процессов
ГЛАВА 2 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Изучение первичной структуры хампина мыши, сс филогенетический анализ и изучение
тканевой специфичности экспрессии его изоформ
Бактериальная продукция фрагментов хампина и получение специфических антител Изучение внутриклеточной локализации изоформ хампина и картирование участков,
содержащих сигналы ядерной локализации
Результаты поиска белковых взаимодействий хампина и его партнеров в дрожжевой
двугибридной системе
Анализ тканевой специфичности партнеров хампина, их краткая характеристика,
филогенетический анализ
Бактериальная продукция партнеров хампина. Получение антител к некоторым белкам.
Разработка двухтеговой системы для экспрессии в бактериях. Свойства белков.
Оптимизация условий связывания на примере взаимодействия МУБТЬхампин
Применение двухтеговой системы для подтверждения взаимодействий и картирования
участков взаимодействий между хампином и некоторыми белками
Характеристика некоторых партнеров хам пина и их колокализация в клетке
Необычные свойства ТТС4 и регуляция ею внутриклеточной локализации
Внутриклеточная локализация белков 10 и ЫЕЬРЭ
ГЛАВА 3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Олигонуклеотидные праймеры для ПЦР, использованные в работе
Конструирование экспрессирующих плазмидных ДНК.
Свойства белков, продуцированных в бактериях
Методы исследования
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Поэтому гомология между хампином и белком 1 может быть причиной их общих функций, сохранившихся в процессе эволюции и, повидимому, связанных с консервативными механизмами реорганизации структуры хроматина применительно к регуляции экспрессии генов. Учитывая интерес, который вызывают в настоящее время исследования в области механизмов регуляции экспрессии генов, мы решили сфокусировать свое внимание на изучении структуры и функции нового белка хампина. Данная работа представляется актуальной как с точки зрения изучения свойств данного белка, так и с точки зрения развития методологии изучения новых, охарактеризованных белков протеома млекопитающих. Целью данной работы было изучение свойств и. Изучить первичную структуру изоформ хампина в модельном организме мыши, а также характер их распределения в различных тканях. В ходе работы нами было впервые изучено разнообразие изоформ хам пина в организме мыши, образующееся в результате альтернативного сплайсинга кодирующей мРНК. Интересной особенностью оказалось, что разные изоформы белка являются результатом использования разных комбинаций экзонов. На основании сравнения первичных структур хампина и его гомологов в организмах животных мы показали, что гены, кодирующие белки данного семейства, присутствуют у членистоногих и позвоночных животных, отсутствуя у круглых червей и представителей других царств эукариот растений и грибов. С помощью обратной транскрипции ПЦР мы показали, что отдельные изоформы хампина содержатся виртуально во всех тканях, тогда как по крайней мере две из его изоформ специфичны для семенников. Мы также изучили внутриклеточную локализацию всех изоформ хампина в организме мыши. Оказалось, что все они имеют ядерную локализацию. Сравнительный анализ структуры изоформ показал, что в молекуле хампина имеет место существование по крайней мере двух сигналов ядерной локализации одного, неизвестного ранее присущего всем изоформам хампина, и другого, который содержится в последовательности высоконсервативного домена РЕНЕ и, вероятно, функционирует как добавочный. Независимо от зарубежных групп исследователей, мы показали, что, как и 1 дрозофилы, хампин млекопитающих способен взаимодействовать с ацетилтрансфсразой. РЕНЕ. Таким образом, одной из его консервативных функций является взаимодействие с ацетилтрансфсразой гистонов 1, важной для ацетилирования гистона Н4 по остатку К как у млекопитающих, так и дрозофилы. С помощью дрожжевой двугибридной системы мы открыли ряд новых взаимодействий хампина, неизвестных для его гомолога 1, и связывающих его функцию с регуляцией активности ДНКполимеразы альфа р 0 и некоторых белковсупрессоров опухолей. Большинство открытых взаимодействий было подтверждено с помощью методов аффинной хроматографии. В ходе проведения данных экспериментов была разработана новая система гибридных белков, позволяющая изучать белокбелковые взаимодействия i vi. Дополнительно, в ходе работы был проведен структурнофункциональный. ТТС4, , ТТС и его партнера 1. В целом полученные результаты позволяют реконструировать фрагмент интсрактома млекопитающих, содержащий в своем центре белок хампин и указывают на то, что он является важным компонентом некоторых сигнальных путей, происходящих в клеточном ядре. В то же время, сложность структуры узла интерактома применительно к отдельно взятому белку показывает, насколько мало изучены в наше время такие процессы как регуляция транскрипции РНКнолимсразой II или ацетилирование гисгонов. Безусловно, данные результаты являются дополнительным стимулом в изучении интерактома млекопитающих. Так, недавно было обнаружена взаимосвязь между функцией белка МУБП и трансформацией клеток , запуском АТМзависимых сигнальных каскадов в ответ па повреждение структуры геномной ДНК 0 а также его роль в регуляции супрессорной активности широко известного белка р . С другой стороны, функция белков КАБББЮ и ТТС4 в механизмах супрессии опухолей остается, малоизученной в наши дни. Очевидно, что открытие новых функциональных взаимосвязей для всех этих белков является важной вехой в изучении их функции и, как следствие, в разработке новых средств терапии рака.