Флуоресцентное исследование нейротоксинов и их взаимодействие с ацетилхолиновым рецептором

• Автор: Сурин, Александр Михайлович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 169 c. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНЫХ РАССТОЯНИЙ В

БЕЛКАХ МЕТОДОМ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ Обзор литературы

1.1. Дипольдипольный резонансный перенос энергии

1.1.1. Теоретические основы .

1.1.2. Зависимость переноса энергии от ориентации донора и акцептора

1.1.3. Подбор донорноакцепторных пар и способы

их введения в биополимер

1.1.4. Примеры определения внутримолекулярных расстояний по переносу энергии .

1.2. Обменнорезонансное и нерезонансное гашение флуоресценции. Определение расстояния мевду флуорофором и тушащей группой
1.2.1. Тушение ароматических флуорофоров клинок сильными радикалами
1.2.2. Тушение флуоресценции остатков триптофана функциональными группами белка
ГЛАВА II. СТРУКТУРА ТРИПТОФАНСОДЕРЖАЩЕГО ФРАГМЕНТА
НЕЙРОТОКСИНОВ. ТОКСИНРБЦЕПТОРНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ
.1. Нейротоксины короткого типа
.1.1. Флуоресценция нейротоксинов и их моноацетильных и моноспинмеченых производных .
.1.2. Влияние на флуоресценцию нейротоксинов и их производных . .
Стр.
.1.3. Тушение флуоресценции нейротоксина II и его моноацетильных производных
ионами иода
.1.4. Поляризация флуоресценции и вращательная релаксация нейротоксина II . .
.1.5. Флуоресценция тринитрофенильного и монодансильных производных нейротоксина
II. Перенос энергии
.2. Нейротоксины длинного типа
.2.1. Спектры кругового дихроизма
.2.2. Флуоресценция остатков триптофана в нейротоксинах длинного типа .
.2.3. Тушение флуоресценции триптофанилов в длинных нейротоксинах акриламидом и
иодидом калия
.2.4. Влияние на флуоресценцию.
.2.5. Флуоресценция и КДспектры монодансильных производных нейротоксина I . .
.3. Взаимодействие нейротоксина II с ацетилхолиновым рецептором.
.3.1. Спектральные свойства солюбилизированного ацетилхолинового рецептора и его комплексов с флуоресцентномечеными производными нейротоксина II .
.3.2. Равновесные параметры связывания нейротоксина II и его производных с солюбилизированным рецептором.
ГЛАВА III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
III.I. Материалы, аппаратура и методы измерений. .
Стр.
1.2. Определение межхромофорных расстояний . .
1.3. Расчет констант диссоциации и стехиометрии токсинрецепторных комплексов
ВЫВОда.
ЛИТЕРАТУРА


Для субъединичных белков необходимо, кроме того, выяснить взаимное расположение субъединиц и их ориентацию относительно активного центра для мембранных белков положение относительно поверхности мембраны. Для решения такого сорта задач приоритет среди флуоресцентных методов принадлежит безызлучательному дипольдипольному резонансному переносу энергии . Возможности этого метода непрерывно расширяются, прежде всего благодаря дальнейшей разработке теоретических основ метода применительно к биообъектам , внедрению непрерывных и импульсных лазеров как источников возбуждения , совершенствованию техники регистрации флуоресценции , и, конечно, поиску новых флуорофоров и способов их направленного введения . Штенсивное проникновение ЭПРспектроскопии в практику изучения биообъектов стимулировало новое направление флуоресцентной спектроскопии применение спиновых зондов в качестве тушителей флуоресценции . Иминоксильный радикал тушит флуоресценцию на расстоянии,соответствующем размерам системы флуорофоррадикал. Благодаря этому совмеотное использование спиновых и флуоресцентных меток позволяет зондировать как непосредственное окружение флуорофора, так и определять расположение групп, удаленных на расстояние, сравнимое с размерами макромолекулы. Поэтому применению методов дипольдипольного резонансного переноса энергии
и тушения флуоресценции нитроксилъными радикалами посвящена основная часть литературного обзора. Последние являются тушителями триптофановой флуоресценции ,, причем эффективность тушения зависит как от зарядового состояния группы, так и ее расположения относительно ароматического хромофора. Анализу данных, относящихся к этому вопросу, отведен заключительный раздел литературного обзора. Дипольдиполъный резонансный перенос энергии. Теоретические основы. Возбужденная частицы молекула, ион, комплекс может вернуться в основное состояние испустив квант света либо потеряв энергию возбуждения за счет безызлучательных переходов. Среди физических путей дезактивации принято выделять безызлучательнуго потерю энергии электронного возбуждения за счет пе
реноса ее на другую первоначально невозбужденную молекулу. А сильное взаимодействие возбужденной молекулы с невозбужденной, при котором наблюдаются значительные изменения в спектре поглощения В слабое взаимодействие изменения в спектре поглощения невелики и сохраняется колебательная структура полос и С очень слабое взаимодействие, когда изменения в спектре поглощения отсутствуют, однако люминесцентные свойства значительно отличаются от тех, которые наблюдаются для изолированных возбужденных молекул. Очень слабое взаимодействие имеет место в растворах флуоресцирующих органических молекул, когда среднее расстояние между ними составляет около 10 длины волны излучения . На практике спектры поглощения и излучения чаще представляют в шкале длин волн Л, а не волновых чисел. Лп л , л л4 а л . Исключением является фактор ориентации К , незнание которого вносит наибольшую неопределенность в расчет величины и . Поэтому методы оценки ориентационного фактора будут ниже рассмот
рены отдельно 1. Теория Фрстера была обобщена Декстером на случай других типов взаимодействия обменнорезонансного, дипольквадрупольного, квадрупольквадрупольного. Было установлено, что для небольших расстояний между донором и акцептором дипольдипольнне, дипольквадрупольные и квадрупольквадрупольные механизмы дают сравнимые вклады в суммарный процесс переноса энергии. На больших расстояниях доминирует дипольдипольный механизм. В случае обменного резонанса энергия взаимодействия экспоненциально убывает при увеличении расстояния между донором и акцептором . Эйзингер и соавт. А см. Дипольдипольный резонансный перенос энергии зависит от взаимной ориентации векторов дипольных моментов перехода излучения донора и поглощения акцептора. Рио. Графики кх рассчитаны для двух вариантов расположения донорноакцепторных пар плоохоотн молекул параллельны, оси оимметрии коллинеарнн xi молекулы лежат в одно плоскости, ови параллельны i . В скобках рядом е кривыми указаны феретеровохие радиусы, использованные для расчета.