С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза Ssoll как бифункциональный белок: изучение взаимодействия с участком метилирования и с промоторной областью генов системы рестрикции-модификации Ssoll

• Автор: Воробьева, Ольга Валерьевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 157 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. Молекулярные аспекты взаимодействии белков семейства Сбцнтозииовмх ДНКмстилтраисфсраз и семейства Сгобелков и рспрсссоров с ДНК Литературный обзор

1.1. Классификация ДНКсвязываюших белков.

1.2. Строение и свойства С5цнтозиновых ДКметилтрансфсраз

1.2.1. Функции ДНКмстилтраисфсраз

1.2.1.1. Биологическое значение метилирования ДНК в прокариотах.

1.2.1.2. Биологическое значение метилирования ДИК в эукариотах

1.2.2. Первичная структу ра С5интознновых ДКмстнлтрансфсраз.

1.2.3. Пространственная структура С5цитозиновых ДКметилтрапсфсраз.

1.2.4. Механизм катализа переноса метальной группы С5цитозиновыми ДНКметалтрансфсразами

1.2.5. Молекулярные механизмы взаимодействия С5иитозиновых

ДНКмстилтраисфсраз с ДНКсубстратом и кофактором.
1.2.5.1. Особенности связывания ДНК С5цитозиновыми ДНКметилтрансферазами
1.2.5.2. Структурные аспекты ДПКбелкового узнавания в комплексах
С5ЦИТИН0ВЫХ ДНКметилтрансфсраз
1.3. Строение и свойства Сгобелков и рспрсссоров.
1.3.1. Структурный мотив спиральповоротсннраль
1.3.2. Представители, входящие в семейство Сгобелков и рспрсссоров.
1.3.3. Биологические функции фаговых рспрсссоров и Сгобелков. Регуляция генов
в жизненном цикле бактериофага .
1.3.4. Структура Сгобелков и рспрсссоров.
1.3.5. Механизм связывания Сгобелков и рспрсссоров с ДНК.
1.3.6. Белокбелковые взаимодействия в структурах Сгобелков и рспрсссоров
ГЛЛВЛ 2. С5цнтолшоиан ДНКметнлтраисфсраза 0 как бифункциональный белок изучение взаимодействии с участком метилировании и с промоторной областью генов системы рестрикциимодификации 8чо
Обсуждение результатов.
2.1. Разработка методики определения неметилирусмого остатка 2дсзокснцнтндина в участке метилирования цнтознновых ДНКметилтрансфсраз.
2.1.1. Установление специфичности действия Д 1Кмстилтраисфсразы Ы1аХ
2.2. Фермент модификации Ббо как С5цитознновая ДНКмстилтраисфсраза
2.2.1. Равновесное связывание мстнлтрансферазы Ббо с участком метилирования
2.2.2. Идентификация групп атомов участка метилирования, взаимодействующих
с мстнлтрансферазой Бзо при формировании специфического комплекса.
2.2.2.1. Взаимодействие мстнлтрансферазы БбоИ с исмодифнцированнымн ДНКсубстратами.
2.2.2.2. Взаимодействие мстнлтрансферазы Бзо с ДНКсубстратами, содержащими
З.мстилдезоксицнтидип в одной из цепей участка метилирования
2.2.3. Роль Суз2 каталитического центра мстнлтрансферазы БбоИ в связывании ДНК.
2.3. Изучение роли мстнлтрансферазы БэоИ в процессе дезаминирования метилируемого цитозина
2.4. Регуляция в системе рестрикциимодификации БзоП. Фермент модификации БэоН
как регуляторный белок
2.4.1. Исследование равновесного связывания мстнлтрансферазы II с регуляторным участком ДНК.
2.4.2. Идентификация групп атомов регуляторного участка ДНК, взаимодействующих
с мстилтрансфсразой II при формировании специфического комплекса.
2.4.3. Ковалентное присоединение мстнлтрансферазы II к ДНК
лигандам, содержащим 2альдегидную группу
2.5. Анализ ДНКбелковых контактов в комплексах мстнлтрансферазы II с регуляторным участком и участком метилирования.
2.6. Моделирование ДНКбелковых взаимодействий в комплексах мстнлтрансферазы
II с регуляторным участком и участком метилирования
ГЛАВА 3. Экспериментальная чает
3.1. Реактивы и материалы
3.2. Приборы и методы.
3.3. Общие методики.
3.3.1. Введение Рмстки в ДНК.
3.3.2. Определение нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК
3.3.3. Исследование равновесного связывания ДНКмстилтрансфсразы II с ДНКлигандами.
3.3.4. Метод отпечатков с использованием ЫэтилКнитрозомочевины в качестве модифицирующего реагента
3.3.5. Метод отпечатков с использованием димстилсульфата в качестве модифицирующего реагента
3.3.6. Метод отпечатков с использованием муравьиной кислоты в качестве модифицирующего реагента
3.3.7. Метод отпечатков с использованием гидразина в качестве
модифицирующего реагента
3.3.8. Ковалентное присоединение ДНКметилтрансфераз Ы1аХ к БбоН
к Д1 1Кдуплексам, содержащим 5фтор2дезоксицитиднп.
3.3.9. Ковалентное присоединение ферментов нуклеинового обмена к ДНКдуилексм, содержащим фосфорилдисульфидную межиуклеотидную группу
3.3 Ковалентное присоединение ДНКмстилтрансфсразы БбоИ к ДКдуплсксам, содержащим 2альдсгидную группу
3.3 Определение эффективности взаимодействия метнлтрансфераз 1ЧаХ и БбоН с
ДКсубетратами
3.3 Определение нсметилирусмого остатка 2дезоксицнтидина в участке узнавания цитозиновых ДНКмстилтраисфсраз.
3.3 Молекулярное моделирование
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Особое внимание уделено исследованию роли СуБ2 каталитического центра МбоИ во взаимодействии с углеводофосфатным остовом ДНК. Впервые для изучения МТаз были использованы ДНКдуплексы, содержащие фосфорнлдисульфидную группу вместо природной фосфодиэфирной межнуклеотидной связи. В ходе работы была предложена методика определения местоположения неметилируемого 6С в участке узнавания цитозиновых ДНКмстилтрапсфсраз, основанная на использовании бнеульфнтной реакции в сочетании с ферментом репарации урацилДНКгликозилазой. Полученные в настоящей работе данные позволили охарактеризовать механизмы образования специфических ДНКбслковых комплексов М. БэоН с участком метилирования и промоторной областью системы РМ ЗэоП и предложить модель взаимодействия С5цнтозиновой ДНКмстнлтрансфсразы БбоИ с ДИК как бифункционального белка. Работа содержит литературный обзор, посвященный молекулярным аспектам взаимодействия семейства С5цитозиновых ДНКмстилтрансфсраз и семейства Сгобслков и рспрсссоров с ДНК. ГЛАВА 1. Классификации ДНКсвнзывагощих белков Примерно генома прокариот и генома эукарнот кодируют ДНКсвязывающис белки . Они играют центральную роль на всех стадиях генетической активности в клетке транскрипции, укладке хроматина, рекомбинации, репликации и репарации. Исследования природы комплексов, сформированных ДНКсвязывающими белками и ДНК, имеют огромное фундаментальное значение, так как позволяют попять механизмы протекания этих процессов в клетке. За последнее десятилетие было получено значительное количество попон информации о структуре ДНКсвязывающих белков и их комплексов с ДНК. Эта информация обеспечила понимание стсрсохимичсских принципов ДНКбелкового взаимодействия, включая информацию о том, как дискриминируется определенная нуклеотидная последовательность ДНК, и почему структура ДНК часто искажается при связывании с белком. Впервые систематическая классификация ДНКсвязывающих белков была предложена Харрисоном и соавт. Она была основана на гомологии в структурах ДНКсвязывающих областей охарактеризованных к тому времени белков. Позднее эта классификация была усовершенствована . Кроме того, были предложены другие способы классификации, принимающие в расчет новые расшифрованные структуры ДНКбелковых комплексов. Так, например, основываясь на структурном анализе 0 ДНК белковых комплексов, размещенных в i , в г. Лускомб и соавт. ДИКсвязывающнс белки на 8 различных структурнофункциональных групп табл. Белки, попавшие в одну н ту же группу, характеризуются наличием определенного структурного мотива, ответственного за
узнавание ДНК. Поэтому названия групп белков, предложенные Лускомбом и соавт. Каждая группа в свою очередь была подразделена на семейства исходя из гомологии вторичной структуры и идентичности биологических свойств белков . Таблица 1. Классификация ДНКсвязывающих белков . В скобках приведены англоязычные названия групп белков. Согласно данной классификации ДНКметилтрансфсраза БбоИ может быть отнесена как к группе белков, использующих для узнавания структурный мотив спиральиоворотспнраль семейство Сгобелков и рспрсссоров, так и к группе ферменты семейство ДНКмстнлтрансферазы. Именно эти два семейства ДПКсвязываюших белков будут подробно рассмотрены в литературном обзоре. ДНКметнлтрансфсразы МТазы это ферменты, узнающие в двутяжевой ДНК короткие нуклеотидные последовательности п. БаденозилЬмстионина ЛбоМсО на остатки цитозина или адснина 1 рис. В зависимости от места модификации субстрата ДНКмстилтрансфсразы могут быть подразделены на МТазы, метилирующие экзоцикличсский атом азота цитозина ш4СМТазы или адснина пз6ЛМТазы и МТазы, метилирующие цитозин по С5атому т5СМТазы. Последние были обнаружены как в прокариотах, так и в эукариотах. При рассмотрении семейства ДНКметилтрансфсраз основное внимание будет уделено т5СМТазам, поскольку они являются наиболее охарактеризованным подсемейством. ДНКметилтрансфсраза БбоИ объект нашего исследования также является т5СМТазой. Рис. Общая схема реакции метилирования. Серым цветом обозначен участок метилирования в ДНК.