Исследование структуры актинопоринов актиний Oulactis orientalis и Radianthus macrodactylus

• Автор: Ильина, Анна Павловна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 118 с. : ил.

Приношу глубочайшую благодарность всем сотрудникам Лаборатории химии пептидов ТИБОХ ДВО РАН, принимавшим участие в проведении исследования.
Выражаю искреннюю признательность за содействие в проведении отдельных разделов работы сотрудникам других лабораторий ТИБОХ ДВО РАН к.м.н. Исаевой М.П., н.с. Лихацкой Т.Н., м.н.с. Гузсву К.В., вед. инженеру Тищенко Л.Я., сотрудникам Института биоорганической химии РАН им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Москва проф. Егорову Ц.А., к.б.н. Липкину и к.б.н. Барсовой Е.В., сотруднику Института биологии моря ДВО РАН Владивосток к.б.н. Костиной Е.Е. за помощь при определении видовой принадлежности актиний.
Содержание

Список сокращений.

Введение


Относящиеся к группе рПФТ полипептиды, в отличие от высоко сиирализованных аПФТ, представляют собой многодоменные структуры с преобладанием баррелыюго типа. В этот класс входят аэролизин 6, агемолизин из 8, цитотоксии из i 6, антиген сибирской язвы 9, семейство холестеринзависимых цитолизинов . Рис. Рис. Ленточная диаграмма структур некоторых представителей аПФТ 6. Темным цветом выделены участки молекул, ответственные за пороформирующую активность токсинов. А Колицин 1а из Е. Б Экзотоксин А из . В инсектицидный 8эндотоксин из В. Г Дифтерийный токсин из С. ПФТ, продуцируемые различными видами живых организмов, действуют на клетки бактерий, насекомых, млекопитающих 6. Мало похожие на первый взгляд структуры всех аПФТ имеют высоко аспирализованные домены рис. Предполагается, что за каждый этап взаимодействия с мембраной, а именно, связывание с рецептором, транслокационное внедрение в мембрану, а также токсическое действие, отвечают определенные домены 6. В доменах аГ1ФТ, ответственных за формирование пор, может присутствовать как одна например, у эквинатоксинов, так и несколько аспиралсй так называемый пучок. Этот пучок имеет трсхслойную структуру, состоящую из 6 аспиралей, где каждый слой сформирован с помощью однойдвух или более аитипараллельных аспиралей, некоторые из которых полностью спрятаны внутри пучка. Первоначальное взаимодействие токсина с мембраной включает распластание пучка аспиралей полипептида на поверхности мембраны. Проникновение в липидный слой сопровождается изменением конформации молекулы. Несмотря на близкий механизм порообразования у всех аПФТ, подобия в аминокислотной последовательности пороформирующих доменов не обнаружено 6. Типичным представителем аПФТ является колицин А, на примере которого был продемонстрирован механизм действия аПФТ , . Полипептидная цепь ко л и ци на А состоит из 4 а. ЗА. Установлено, что восьмая и девятая аспирали находятся внутри трехмерной структуры . На основании этой структурной особенности молекулы была предложена зонтичная модель проникновения токсина в мембрану. Б . Проникновение заряженных аминокислотных остатков в мембрану энергетически невыгодно, внедрение шпильки в мембрану инициирует такое конформационное изменение молекулы, при котором, два внешних, обрамляющих восьмую и девятую аспирали слоя, остаются вне мембраны подобно раскрытому зонтику. При этом их гидрофобные внешние стороны оказываются расположенными на поверхности бислоя рис. ЗБ . Зонтичная модель была тщательно проверена экспериментально. Методом цистеинсканирующего мутагенеза было показано, что введение дисульфидных связей между 1 и 9, 5 и 6, 9 и аспирапями приводит к инактивации токсина, так как молекула теряет способность раскрываться в виде зонтика . Методами флуоресцентной спектроскопии было установлено, что гидрофобная шпилька, образуемая 8 и 9 аспиралями глубоко погружается в липидный бислой, тогда как амфифильные и аспирали располагаются на поверхности мембраны . Последующие конформационные изменения затрагивают все гидрофобные шпильки, образуемые 3, 4, 5, 6 и частично 7 аспиралями, что приводит к дальнейшему включению их в липидный бислой рис. ЗВ , . Повидимому, положительный заряд аминокислотных остатков асииралей, кольцом окружающих гидрофобную шпильку, играет важную роль в первоначальном электростатическом взаимодействии колицина А с отрицательно заряженными липидами мембран и в ориентации молекулы, необходимой для внедрения шпильки в мембрану . Кроме того, важным для конформационных перестроек молекулы колицина А, происходящих при включении ее в мембрану, является наличие остроконечных полостей в белковом коре рис. ЗА . Установлено, что формирующий пору домен колицина А переходит в состояние расплавленной глобулы, при этом разрушается его третичная структура, но сохраняется вторичная , . В промежуточном состоянии расплавленной глобулы уменьшается энергетический барьер для раскрытия гидрофобной шпильки при ее встраивании в мембрану . Данное состояние молекулы инициируется низким значением на поверхности мембран, содержащих кислые липиды.