Разработка методов синтеза модифицированных олигонуклеотидов с использованием Н-фосфонатной конденсации

• Автор: Есипов, Дмитрий Станиславович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 101 с. : ил.

Содержание
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Н-ФОСФОНАТНЫЙ МЕТОД СИНТЕЗА ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ
Нуклеозид Н-фосфонаты (методы получения)
Синтез олигодезоксириеонуклеотидов
Стадия детритилирования
Стадия конденсации
Стабильность олигонуклеотид Н-фосфонатов
Стадия кепирования
Стадия окисления
Синтез модифицированных олигонуклеотидов
Заключение
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Разработка методов синтеза олигонуклеотидов, модифицированных по 5'- или 3'-концу
Синтез 5 ’-фосфорилированных олигодезоксирибонуклеотидов
Синтез олигонуклеотида, терминированного З’-азидотимидином
Разработка метода синтеза олигонуклеотидов, содержащих липофильные группы
Синтез церамидфосфотимидина
Синтез церамидфосфоазидотгшидина
Разработка метода синтеза модифицированных олигонуклеотидов на основе реакции Тодда-Атертона
Изучение устойчивости амидофосфатной межнуклеотидной связи в условиях олигонуклеотидного синтеза
Синтез олигонуклеотида с аминоспейсером и его иммобилизация на поверхности макропористого носителя
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Приборы и материалы
Методы
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

вэжх

ПААГ

Ас20
AZT (azT)

DCCD
DEAE
DMTr

FmocCl
G’Bu
Melm
N-MM
(NPh-Et)p
PivCl
p-NPh-OH

fref-BuDMe

TEAAc
TEAB

TPSC1

Список используемых сокращений
- высоко-эффективная жидкостная хроматография
- дихлоруксусная кислота
- полиакриламидный гель
- N6-6emowi 2’-дезоксиаденозин
- уксусный ангидрид
- З’-азидотимидин
- нуклеиновые основания
- 1Ч4-бензоил 2’-дезоксицитидин
- control pore glasse (макропористое стекло с контролируемым размером пор)
- 1,8-диазобицикло-[5.4.0]-ундец-7-ен
- дициклогексилкарбодиимид
- диэтиламиноэтил
- диметокситритильная группа
- 3 ’-дезокси-2’,3’-дидегидротимидин
- флуоренилметоксикарбонилхлорид
- ІхР-изобутирил 2’-дезоксигуанозин
- N-метилимидазол
- N-метилморфолин
- п-нитрофенилэтил фосфат
- пивалоилхлорид
- и-нитрофенол
- пиридин
- обратная транскриптаза
- тимидин (2’-дезокситимидин)
- «рет-бутилдіметил
- триэтиламин
- триэтиламмония ацетат
- триэтиламмония бикарбонат
- тетрагидрофуран
- триизопропилбензолсульфохлорид
- триазол

Введение
Олигонуклеотиды в настоящее время являются незаменимыми инструментами для генной инженерии. В последнее время они находят все большее применение и в медицине для диагностики наследственных и вирусных заболеваний. Делаются попытки использовать олигонуклеотидные производные для генетической коррекции организма. Новейшие разработки по использованию иммобилизованных олигонуклеотидов дают возможность реализации высокоскоростного секвенирования нуклеиновых кислот. Модифицированные олигонуклеотиды, несущие различные активные группы, испытываются как терапевтические препараты. Поэтому разработка и совершенствование методов синтеза модифицированных олигонуклеотидов, а также изучение их физико-химических и молекулярнобиологических свойств является одной из ключевых задач биоорганической химии.
Целью работы являлась разработка методов синтеза модифицированных олигонуклеотидов, содержащих функциональные группы ненуклеотидной природы или модифицированные нуклеозиды.
Научная новизна и практическая значимость работы
использованием Н-фосфонатной конденсации разработаны методы введения в олигонуклеотиды 5’-фосфатной группы, З’-концевого остатка азидотимидина, спейсерной аминогруппы по межнуклеотидному фосфату, липофильного 5’-концевого остатка церамида. Изучена стабильность амидофосфатдиэфирной связи в условиях олигонуклеотидного синтеза

олигояуклеотидной цепи. Для временной защиты фосфатов, не
подвергающихся модификации в Н-фосфонатном синтезе, использовались метоксигруппы. Незащищенные Н-фосфонатные диэфиры были преобразованы в фосфорамидаты обработкой алкиламином, и после заключительного снятия защитных групп фосформетоксигруппы
образовывали фосфодиэфиры.
Синтез фосфорамидатных олигодезоксирибонуклеотидов (Р-МНг) и смешанных фосфорамидат-фосфодиэфирных олигомеров был выполнен в автоматическом режиме на твердофазном ДНК-синтезаторе с
использованием Н-фосфонатного и фосфорамидитного подходов, в комбинации с тре/и-бутилфеноксиацетильной защитной группой для Ы-защиты нуклеозидных оснований, оксалильным якорем для твердофазной подложки и заключительной стадией обработки аммиаком в метаноле. Как ожидалось, олигонуклеотиды с Р-ИНг модификацией оказались устойчивы к действию различных нуклеаз [79].
Фосфамиды олигонуклеотидов синтезировали с высоким выходом при окислении сси в присутствии первичных или вторичных аминов (Схема 12). С помощью этой процедуры успешно вводились фосфамиды по фосфату в работах [48-55].