Окислительное расщепление ДНК аренами и их олигонуклеотидными конъюгатами в присутствии ионов Cu(II)

• Автор: Коваль, Ольга Александровна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 136 с. : ил

Введение

1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КОМПЛЕКСОВ МЕДИ С Ю

НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ Обзор литературы

1.1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ИОНОВ МЕДИ С НУКЛЕИНОВЫМИ

КИСЛОТАМИ

1.1.1. Связывание ионов меди с нуклеиновыми кислотами

1.1.2. Механизм реакции Фентона

1 Взаимодействие активных форм кислорода с нуклеиновыми

кислотами

1.1.4. Реакция Фентона i viv

1.1.4.1. v в ЛИК, возникающие под действием кислородных

радикалов
1.1.4.2. Воспаление и окислительный стресс
1.2. РАСЩЕПЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
КОМПЛЕКСАМИ МЕДИ И МЕДЬЗАВИСИМЫМИ
СИСТЕМАМИ
1.2.1. Комплексы меди, осуществляющие окислительную деструкцию
нуклеиновых кислот
1.2.1.1. Комплексы меди и медьзависимые системы.
осуществляющиеокислителен уюдеструкцию
нуклеиновых кислот в присутствии тиолов или Н0.
1.2.1.2. Окислительная деструкция нуклеиновых кислот
комплексами меди, действующими без активации
экзогенными окислителями или восстановитешми
1.2.2. Комплексы меди, осуществляющие гидролитическую
деструкцию нуклеиновых кислот
1.3. САЙТНАПРАВЛЕННОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ КОНЪЮГАТАМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С КОМПЛЕКСАМИ МЕДИ
.1. Расщепление ДНК и РНК конъюгатами олигонуклеотидов с
комплексами меди в двуцепочечном комплексе
.2. Расщепление ДНК и РНК конъюгатами олигонуклеотидов с
комплексами меди в триплексе
1.4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. МАТЕРИАЛЫ
2.1.1. Реактивы и оборудование
2.1.2. Олигонуклеотиды
2 Буферные растворы, используемые в работе
2.2. МЕТОДЫ
2.2.1. Введение Рметки по 5 концу олигону клеотида
2.2.2. Производные олигонуклеотидов
2 Выделение су спензионного хроматина из плаценты человека
2.2.4. Выделение растворимой фракции хроматина из плаценты человека
2.2.5. Отделение гистона Н1 от хроматина
2.2.6. Выделение нуклеосом 2.2.7. Анализ препаратов на содержание коровых гнстонов и ДНК
нуклеосомной длины
2.2.8. Реконструкция нуклеосомной цепи на фрагменте ДНК
2.2.9. Депротеиннзация
2.2 Приготовление компетентных клеток
2.2 Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК
2.2 Выделение плазмидной ДНК
2.2 Амплификация фрагмента ДНК промотора гена
2.2 Очистка ПЦРпродуктов
2.2 Модификация ДНК ал кили рующнм производным
олигонуклеотида
2.2 Реакция ДНК с ИЕРС
2.2 Картирование местоположения гистонового октамера
мнкрококковой нуклеазой
2.2 Картирование местоположения гистонового октамера с помощью 0бромбензойной кислоты
2.2 Расщепление фрагмента ДНК по пуринам методом Максама
Г илберта
2.2 Регистрация спектров ЭПР спиновой ловушки
2.2 Регистрация спектров ЭПР комплексов медн в присутствии остатков гуанина или олигонуклеотидов.
2.2 Расщепление ДНК плазмиды в системе аренмедь
2.2 Расщепление олигонуклеотидов в системе аренмедь
2.2 Модификация ДНК конъюгатом олигонуклеотида с
фталоцнанином кобальтаП
2.2 Расщепление ДНК конъюгатом олигонуклеотида с
блеомицином А
2.2 Расщепление ДНК конъюгатом олигонуклеотида с аминопропнлсульфамонлом2бромбензойной кислоты
3. РАСЩЕПЛЕНИЕ ДНК АРЕНАМИ И ИХ
ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫМИ КОНЪЮГАТАМИ В
ПРИСУТСТВИИ ИОНОВ Си Результаты и
обсуждение
3.1. РАСЩЕПЛЕНИЕ ДНК ЗАМЕЩЕННЫМИ БЕНЗОЙНЫМИ
КИСЛОТАМИ В ПРИСУТСТВИИ ИОНОВ СиН
3.1.1. Расщепление ДНК аренами различной структуры в
присутствии ионов Си
3.1.2. Исследование закономерностей расщепления ДНК под
действием обромбензойной кислоты в присутствии ионов СиИ
3.1.3. Исследование специфичности расщепления ДНК под действием обромбензойной кислоты в присутствии ионов СиП
3.1.4. Исследование связывания ионов меди с ДНК в системе 9 СиНобромбснзойная кислота
3.2. РАСЩЕПЛЕНИЕ ДНК КОНЪЮГАТАМИ
ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С ПРОИЗВОДНЫМИ ОБРОМБЕНЗОЙНОЙ КИСЛОТЫ В ПРИСУТСТВИИ ИОНОВ Си II
3.2.1. Выбор модели и синтез конъюгата олигонуклеотида с остатком обромбензойной кислоты
3.2.2. Расщепление ДНК ареновым производным олигонуклеотида в дуплексе
3.2.3. Расщепление двуцепочечной ДНК ареновым производным олигонуклеотида в триплексе
3.3. САЙТСПЕЦИФИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ ДНК В 9 СОСТАВЕ РЕКОНСТРУИРОВАННОЙ НУКЛЕОСОМНОЙ ЦЕПИ
.1. Применение системы СиНобромбензойная кислота для 1 картирования ДНКбелковых взаимодействий на примере реконструированной нуклеосомной цепи.
3.3.2. Сайтнаправлсннос алкилирование ДНК в составе 3 реконструированной нуклеосомной цепи в условиях образования специфического трехтяжевого комплекса Выводы
Список литературы


В настоящей работе исследовали возможность создания на основе галогензамещенных производных бензойной кислоты реакционноспособных производных олигонуклеотидов как для направленного расщепления ДНК так и для изучения структуры ДНКбелковых комплексов. Целью работы являлось создание новых реагентов для расщепления ДНК на основе замещенных производных бензойной кислоты и исследование закономерностей их действия в присутствии ионов меди II. Расщепление ДНК аренами в присутствии ионов СиП и установление закономерностей этой реакции. Исследование свойств реакционноспособного производного олигонуклеотида на основе обромбензойной кислоты как реагента для сайтналравленного расщепления ДНК в двуспиральном и трехспиральном комплексе. ДНК ,. Возможность применения системы СиИобромбензойная кислота для определения положения нуклеосомного кора на ДНК в составе реконструированной нуклеосомы и исследование доступности ДНК в составе реконструированной нуклеосомной цепи для модификации производными олигонуклеотидов. ГЛАВА 1. Медь является одним из микроэлементов, определенная концентрация которого важна для функционирования живой клетки, а его избыток или недостаток приводит к развитию патологических состояний организма . С одной стороны, ионы меди в организме являются кофакторами для множества ферментов, таких как цитохром с оксид аз , супероксиддисмутаза, церулоплазмин, тирозиназа, лизил оксид аза, дофамин монооксигеназа , большинство из которых катализируют окислительновосстановительные реакции, где косубстратом является молекулярный кислород. С другой стороны, медь сильнейший яд, е избыток в организме ведет к повреждению клеток. Ионы меди и их комплексы i viv индуцируют образование реакционноспособных кислородных частиц, вызывающих окислительное повреждение важнейших биомолекул, главным образом ДНК и липидов клеточных мембран. Расщепление цепи ДНК и модификация азотистых оснований в клетке может приводить к мутагенезу и карценогенезу. В настоящее время известно множество как природных, так и синтетических комплексов меди, вызывающих повреждение нуклеиновых кислот имеются также соединения, не образующие комплексов с ионами СиН, однако способные расщеплять ДНК в их присутствии, так называемые медьзависимые системы. Некоторые из металлокомплексов, например фснантролины, блеомицияы, комплексы меди с аминогликозидами, трипиридины представляют интерес для конструирования реагентов, направленно повреждающих нуклеиновые кислоты другие соединения, такие как тиолы, , витамин Е исследуются для моделирования медьзависимых окислительных процессов, протекающих внутри клетки 8,. Задачей обзора является рассмотрение данных по повреждению нуклеиновых кислот свободными комплексами меди и их конъюгатами с олигонуклеотидами. Нуклеиновые кислоты, выделенные из различных организмов, содержат большое количество прочно связанных катионов металлов, таких как медь, железо, цинк, хром, никель, марганец и алюминий . Поскольку локализация иона меди в растворе определяет место генерации короткоживухцих кислородных радикалов, связывание ионов меди с ДНК является важным фактором, влияющим на эффективность расщепления или модификации ДНК. Согласно многочисленным экспериментальным данным, наиболее предпочтительной структурой металлокомплексов нуклеотидов является хелат, представляющий собой ион металла связанный одновременно с кислородом фосфатной группы и соответствующим гетероциклическим основанием . При изучении комплексообразования ионов Си2 с 2дезоксинуклеозид5фосфатами, содержащими канонические основания установлено, что атомами, координирующими медь в комплексах являются 7 в и и 3 в и . Атом 7 гуанина является предпочтительным местом связывания двухвалентных ионов металлов, благодаря доступности и наибольшей избыточной плотности делокализованных электронов. Другими возможными местами связывания металла являются атомы гуанина, 7 и 1 аденина и 3 и цитозина. Фосфатные группы и ОНгруппы рибозы в двухнитевых цепях РНК или синтетических полирибонуклеотидах тоже могут участвовать в комплексообразовании с ионами металлов . При образовании комплексов с азотистыми основаниями в составе природной ДНК ионы меди могут дестабилизировать двухцепочечную структуру и вызывать конформационные переходы в этих молекулах.