Неферментативная рекомбинация молекул РНК в реакциях расщепления/лигирования

• Автор: Лутай, Алексей Валериевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 104 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ б

1 ГЛАВА 1. НЕФЕРМЕНТАТИВНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ ФОСФОДИЭФИРНОЙ

СВЯЗИ МЕЖДУ ФРАГМЕНТАМИ РНК РЕАКЦИЯ ЛИГИРОВАНИЯ ОБЗОР

ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 ВВЕДЕНИЕ

1.2 КОНДЕНСИРУЮЩИЕ АГЕНТЫ КАРБОДИИМИДЫ И БРОМЦИАН

1.3 АКТИВИРОВАННЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ФОСФАТА

1.3.1 Лигирование фосфоримидазолидных производных нуклеиновых кислот

1.3.2 Лигирование 2,Зциклофосфатсодержащих нуклеиновых кислот

1.3.3 Лигирование бтрифосфатсодержащих нуклеиновых кислот
1.4 РИБОЗИМЫ
1.5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ
2 ГЛАВА 2. НЕФЕРМЕНТАТИВНАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ МОЛЕКУЛ РНК В РЕАКЦИЯХ РАСЩЕПЛЕНИЯ ЛИГИРОВАНИЯ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
2.1 ИССЛЕДОВАНИЕ МАТРИЧНОНАПРАВЛЕННОЙ РЕАКЦИИ ЛИГИРОВАНИЯ
ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ, НЕСУЩИХ 2,3ЦИКЛОФОСФАТ
2.1.1 Выбор модели, дизайн олигонуклеотидов
2.1.2 Зависимость эффективности реакции лигирования от буфера и присутствия
ионов магния
2.1.3 Кинетика реакции неферментативного лигирования и выбора длительности
инкубации для исследования реакции
2.1.4 Зависимость выхода продукта лигирования от температуры
2.1.5 Зависимость эффективности реакции лигирования от и присутствия ионов
металлов
2.1.6 Влияние этилового спирта и хлорида натрия на эффективность образования
продукта лигирования
2.1.7 Заключение
2.2 АНАЛИЗ ОБРАЗУЮЩЕЙСЯ ФОСФОДИЭФИРНОЙ СВЯЗИ
2.2.1 Обоснование метода
2.2.2 Анализ образующейся связи методами ферментативного и щелочного
гидролиза
2.3 ИССЛЕДОВАНИЕ МАТРИЧНОНАПРАВЛЕННОЙ КОМБИНИРОВАННОЙ
РЕАКЦИИ РАСЩЕПЛЕНИЯЛИГИРОВАНИЯ ХИМЕРНОГО ДНКРНК ОЛИГОНУКЛЕОТИДА.
2.3.1 Выбор модели
2.4 РЕКОМБИНАЦИЯ МОЛЕКУЛ РНК ЧЕРЕЗ СОПРЯЖЕННЫЕ АКТЫ РАСЩЕПЛЕНИЯЛИГИРОВАНИЯ В ПРИСУТСТВИИ КОМПЛЕМЕНТАРНОЙ МАТРИЦЫ
2.4.1 Выбор модели
2.4.2 Влияние ионов металлов на эффективность протекания реакции
расщеплениялигирования
2.4.3 Влияние температуры на эффективность образования продуктов лигирования
2.4.4 Скорость накопления продукта лигирования
2.4.5 Влияние соотношения концентраций олигонуклеотидов на эффективность
образования продукта лигирования
2.4.6 Анализ образующейся связи методом ферментативного гидролиза
2.5 ЗНАЧЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
3 ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 ВВЕДЕНИЕ РМЕТКИ ПО 5КОНЦУ ОЛИГОНУКЛЕОТИДА
3.2 ГИДРОЛИЗ ФОСФОДИЭФИРНОЙ СВЯЗИ ГИДРОКСИДОМ НАТРИЯ
3.3 ПОЛУЧЕНИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С 2,3ЦИКЛОФОСФАТОМ НА ЗКОНЦЕ
3.4 ГИДРОЛИЗ 23ЦИКЛОФОСФАТА
3.5 ПОЛУЧЕНИЕ ДВУЦЕПОЧЕЧНОГО КОМПЛЕКСА ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ
3.6 ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ОБРАЗОВАНИЯ ПРОДУКТОВ
ЛИГИРОВАНИЯ
3.7 ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ОБРАЗОВАНИЯ ПРОДУКТОВ ЛИГИРОВАНИЯ
В ПРИСУТСТВИИ ИОНОВ МЕТАЛЛОВ
3.8 ВЫДЕЛЕНИЕ ПРОДУКТОВ ЛИГИРОВАНИЯ
3.9 ФЕРМЕНТАТИВНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ ПРОДУКТОВ ЛИГИРОВАНИЯ
РИБОНУКЛЕАЗОЙ Т1
3. РАСЩЕПЛЕНИЕ ПРОДУКТА ЛИГИРОВАНИЯ ПРИ 9.0 В
ПРИСУТСТВИИ ИОНОВ Мд2
3. ДЕФОСФОРИЛИРИРОВАНИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗОЙ
3. ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ЛИГИРОВАНИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С
ПОМОЩЬЮ ДНКЛИГАЗЫ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


ГЛАВА 1. ГЛАВА 2. РЕАКЦИИ РАСЩЕПЛЕНИЯЛИГИРОВАНИЯ ХИМЕРНОГО ДНКРНК ОЛИГОНУКЛЕОТИДА. ГЛАВА 3. РАСЩЕПЛЕНИЕ ПРОДУКТА ЛИГИРОВАНИЯ ПРИ 9. Ключевым этапом возникновения жизни является период, на котором молекулы РНК, возникшие в ходу пребиотического синтеза, существовали в формате пространственно обособленных молекулярных ансамблей, способных к самовоспроизведению и эволюции, что в итоге привело к формированию молекулярногенетических и биохимических основ современной организации жизни 1. Одним из вопросов, связанных с развитием мира РНК, является следующий в результате каких реакций в пребиотическом мире, в отсутствие белковых ферментов, происходило усложнение молекул РНК и увеличение их размера Самовоспроизведение имеющихся молекул подразумевает существование процессов репликации полимеризации, а эволюция наличие процессов генерации изменчивости молекул РНК рекомбинации. Возможным вариантом процесса, который может приводить к увеличению разнообразия и удлинению молекул РНК, является неферментативная рекомбинация, протекающая с участием 2,3циклофосфата 2. Расщепление РНК приводит к образованию фрагментов, несущих на Зконце 2,3циклофосфат, который может взаимодействовать с 5ОН группами других фрагментов РНК. Принципиальная возможность реакции лигирования олигонуклеотидов с участием вышеупомянутых групп была показана в работах 35. Хотя в использованных условиях лигирование олигонуклеотидов протекало с низкой эффективностью, можно предположить, что простейшие вещества, присутствовавшие в пребиотическом бульоне и способные ускорять реакции трансэтерификации например, ионы металлов, могут также повышать и эффективность реакций лигирования РНК. Целью настоящей работы является изучение реакции неферментативного лигирования фрагментов РНК, которая могла бы иметь место в пребиотических условиях. Выяснение особенностей протекания реакции, а именно влияния на эффективность образования продуктов лигирования двухвалентных ионов металлов, буфера и температуры среды, скорости реакции. Выделение продуктов лигирования и определение типов изомеров фосфодиэфирной связи. Моделирование условий возникновения пребиотических молекул РНК требует обоснования двух ключевых моментов выбора способа активации фосфатного остатка для образования фосфодиэфирных связей и дальнейшей эволюции выбранного типа реакций. Считается, что на начальных этапах развития РНКмира имела место активация нуклеотидов высокоактивными соединениями, при этом образование межнуклеотидных связей происходило в результате концентрирования активированных предшественников в результате высыхания раствора моделирование капли органического бульона или при адсорбции на минералах 6. Основным препятствием для использования активированных фосфатов в синтезе межнуклеотидных фосфодиэфирных связей является конкуренция между гидроксогруппами нуклеотида и воды за электрофильный атом фосфора активированного фосфата Рис. Рис. Реакции расходования активированного производного фосфата нуклеиновой кислоты. X заместитель. Положение отрицательного заряда указано схематично и символически отображает диссоциацию одного протона от фосфатной группы. При синтезе в безводных средах взаимодействие происходит с самым сильным нуклеофилом, которым в отсутствие воды является кислород гидроксильной группы нуклеотидного компонента.