Взаимодействие тРНКPhe с комплементарными олигонуклеотидами: кинетический механизм и влияние на функциональную активность тРНК

• Автор: Сериков, Роман Николаевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 127 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ Список сокращений Введение

Природные механизмы, обеспечивающие специфическое РНКРНК взаимодействие Обзор литературы
Введение


Чаще всего исследовали термодинамические параметры взаимодействия олигонуклеотидов с ДНК или РНК мишенями, намного реже проводили исследование кинетического механизма образования комплексов. Детальный механизм взаимодействия олигонуклеотидов с природными высокоструктурированными РНК пока не был изучен в достаточной степени. Целью настоящей работы являлось детальное изучение механизма и эффективности направленного воздействия на природные структурированные РНК на примере модельной системы, в которой использовались 0 из дрожжей и ряд направленных к этой тРНК олигонуклеотидов. Оценка влияния ангисмысловых олигонуклеотидов на функциональную активность природной тРНКРге из дрожжей в реакции аминоацилирования. Сравнение предельного уровня аминоацилирования тРНК с данными по взаимодействию с ней олигонуклеотидов, полученных при помощи метода задержки в геле. Дизайн и препаративный синтез флуоресцентных производных олигонуклеотидов и РНК, которые позволили бы проводить прямой мониторинг взаимодействия олигонуклеотида с РНК. Оптимизация методики введения флуоресцентных групп в различные типы нуклеиновых кислот. Детальное изучение кинетического механизма взаимодействия антисмыслового олигонуклеотида с дрожжевой тРНК с помощью комбинации методов остановленной струи и резонансного переноса энергии флуоресценции , . Разработка математической модели для анализа кинетических данных по взаимодействию антисмыслового олигонуклеотида с тРНК. Выявление всех промежуточных метастабильных состояний РНК, которые она может претерпевать в ходе взаимодействия с олигонуклеотидом. В точение последних нескольких десятилетий было разработано большое число методов направленного воздействия на ДНК и РНК с целью регуляции экспрессии генов 3,4,. Эти методы основаны, главным образом, на образовании специфических комплексов биологически активных олигомеров например, олигонуклеотидов с выбранной мишенью, в роли которой чаще всего выступают различные РНК, а также могут выступать ДНК, рис. РНК, премРНК или вирусной РНК 2,. Образование стабильного комплементарного комплекса антисмысловой олигонуклеотидРНК или блокировало трансляцию, вызывало альтернативный сплайсинг, или приводило к расщеплению этой РНК в составе гетеродуплекса клеточной РНКазой Н. Основными проблемами, с которыми сталкивались исследователи при создании антисмысловых и геннаправленных олигонуклеотидов, были отсутствие стабильности олигонуклеотидов в клеточной среде или организме, недостаточная стабильность комплекса, образуемого этим олигонуклеотидом с РНК или ДНК мишенью, а также проблема неэффективной самостоятельной доставки олигонуклеотидов внутрь клетки. Решение этих проблем привело к разработке широкого спектра модифицированных аналогов олигонуклеотидов с улучшенной нуклеазоустойчивостью , улучшенными гибридизационными свойствами скорость связывания и равновесные константы образования комплексов , реакционноспособных аналогов олигонуклеотидов , синтетических микроРНК и экспрессирующих их векторов , малых интерферирующих РНК , ДНКзимов и рибозимов ,. Как хорошо известно, молекулы РНК обладают сложной пространственной структурой, которая стабилизирована внутримолекулярными взаимодействиями между петлями, стэкингвзаимодействиями между основаниями в петлях или стеблях шпилек, связыванием с ионами двухвалентных металлов и белками . Прочная пространственная структура РНК является основным фактором, снижающим эффективность действия как антисмысловых олигонуклеотидов и их реакционноспособных аналогов, так и ДНКзимов, рибозимов и других коротких нуклеиновых кислот, направленных к РНКмишени. Рис. Пути регуляции экспрессии генов при помощи синтетических олигонуклеотидов . Связывание олигомера с ДНК. РНК или мРНК в ядре клетки, с мРНК или белком в цитоплазме приводит к селективному подавлению экспрессии данного гена или ингибированию функции белка в случае использования аптамеров. РНК практически отсутствуют, и реальные мишени для олигонуклеотидов или антисмысловых РНК представляют собой элементы трехмерной укладки определенных нуклеотидных последовательностей ,.