Бинарные рибозимы "головка молотка"

• Автор: Воробьева, Мария Александровна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 121 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

1. КОНСТРУИРОВАНИЕ И СВОЙСТВА РИБОЗИМОВ ГОЛОВКА МОЛОТКА ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Строение и свойства рибозима головка молотка

1.1.1. Разделение рибозима головка молотка на субстратную и каталитическую части

1.1.2. Субстратная специфичность рибозима

1.1.3. Пространственная структура рибозима головка молотка

1.1.4. Роль ионов двухвалентных металлов в расщеплении РНК рибозимом головка молотка

1.1.5. Кинетическая схема расщепления РНК рибозимом головка молотка

1.2. Создание искусственных рибозимов головка молотка для направленного расщепления РНК

1.2.1. Минимизация длины рибозима головка молотка

1.2.1.1. Минизимы

1.2.1.2. Димерные минизимы
1.2.1.3. Рибозимы, содержащие ненуклеотидные вставки
1.2.1.4. Двухкомпонентные рибозимы
1.2.2. Повышение устойчивости рибозимов в биологических средах
1.2.3. Регуляция каталитической активности рибозимов
1.2.3.1. Использование молекулэффекторов для регуляции каталитической активности рибозима головка молотка
Олигонуклеотидыэффекторы, комплементарные РНКсубстрату
Аллостерические эффекторы
Олигонуклеотидыэффекторы, способные связываться с НКэнзимом и с субстратом одновременно
1.2.3.2. Подходы к увеличению эффективности расщепления структурированных природных РНК рибозимами
1.3. Применение рибозимов головка молотка
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Реактивы и приборы
2.2. Основные методы работы
2.3. Методики эксперимента
2.3.1. Выделение и анализ олигонуклеотидов
2.3.2. Введение радиоактивной метки в синтетические РНКсубстраты
2.3.3. Введение радиоактивной метки в 0звенный фрагмент
1 мРНК 0
2.3.4. Гидролиз 0 в имидазольном буфере и с помощью РНКазы Т1
2.3.5. Расщепление РНК бинарными и полноразмерными рибозимами
Расщепление синтетического фрагмента 1 мРНК
Определение кинетических параметров Км и кса расщепления рибозимами
Расщепление 0звенного фрагмента 1 мРНК рибозимами
Определение кинетических параметров Км и расщепления 0 рибозимами
2.3.6. Исследование сборки комплекса бинарный рибозимРНК методом нативного гельэлектрофореза
2.3.7. Исследование кинетических циклов бинарного и полноразмерного рибозимов
Определение констант скорости ассоциации рибозимсубстратных комплексов для полноразмерного рибозима, бинарного рибозима и компонентов бинарного рибозима
Определение констант скорости диссоциации рибозимсубстратных комплексов
Определение констант скорости диссоциации продуктов расщепления РНК от бинарного и полноразмерного рибозимов
2.3.8. Исследование устойчивости компонентов бинарного рибозима в культуральной среде
3. СОЗДАНИЕ БИНАРНЫХ РИБОЗИМНЫХ КОНСТРУКЦИЙ НА ОСНОВЕ МОДЕЛИ ГОЛОВКА МОЛОТКА И ИЗУЧЕНИЕ ИХ СВОЙСТВ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Немодифицированный бинарный рибозим конструирование и каталитическая активность
3.2. Бинарные рибозимы с модифицированным стеблем II
3.3. Сравнение кинетических схем расщепления РНК бинарным и полноразмерным рибозимами
3.3.1. Исследование сборки комплексов рибозимРНК и их диссоциации
3.3.2. Исследование скорости диссоциации продуктов расщепления РНК от рибозима
3.4. Модифицированные бинарные рибозимы, устойчивые в биологических средах
3.4.1. Устойчивость бинарных рибозимов к действию нуклеаз сыворотки
3.4.2. Каталитическая активность модифицированных бинарных рибозимов
3.5. Расщепление 0звенного фрагмента 1 мРНК бинарными и полноразмерными рибозимами
ЛИТЕРАТУРА
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
В настоящей работе использованы символы и сокращения структурных компонентов нуклеиновых кислот и их производных в соответствии с рекомендациями Комиссии по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии ШРАС и международного союза биохимиков ШВ, а также следующие обозначения
В гетероциклическое основание р концевой фосфат
Т,Пу остаток тимидина, присоединенный ЗЗфосфодиэфирной связью
РНК рибонуклеиновая кислота
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
мРНК информационная РНК
тРНК транспортная РНК
РИА пептиднуклеиновая кислота
ВИЧ вирус иммунодефицита человека
АТФ аденозинтрифосфат
АДФ аденозиндифосфат
ПААГ полиакриламидный гель
Трис трисоксиметиламинометан
БЭТА этилендиаминтетрауксусная кислота
БМЫ флавинмононуклеотид
НЕРЕБ 2гидроксиэтил1пиперазинилэтансульфоновая кислота 1т имидазол
1МЭМ культуральная среда Дульбекко, модифицированная по Искову
Рйп остаток 2гидроксиэтилфеназиния
БЭЗ додецилсульфат натрия
АЯг полноразмерный рибозим головка молотка
БИг левая цепь бинарного рибозима головка молотка
ЯЯг правая цепь бинарного рибозима головка молотка
ЯЫА звенный РНКсубстрат
Ю4Ат нерасщепляемый аналог звенного РНКсубстрата ЯЫА0 0звенный РНКсубстрат
ВВЕДЕНИЕ


Огкрытие молекул РНК, обладающих высокоспецифической РНКгидролизующей активностью, привело к пересмотру роли РНК в клетке и положило начало многочисленным исследованиям каталитических РНК, получивших название рибозимов. Впервые каталитически активные РНК были обнаружены Т. I группы i Было показано, что молекула РНКтранскрипта предшественника рибосомной РНК способна катализировать вырезание из своего состава интрона без участия какихлибо белковых молекул. Практически одновременно . РНКсубъединица РНКазы Р способна расщеплять РНКсубстрат предшественник тРНК в отсутствие белковой субъединицы фермента. РНК патогенных вирусов растений. Интроны I и II группы и РНКаза Р представляют собой достаточно длинные молекулы РНК их длина составляет несколько сотен нуклеотидов. Рибозим сателлита Варкуда занимает промежуточное положение его минимальная длина составляет 4 нуклеотида. Наиболее детально из коротких рибозимов исследован рибозим головка молотка, обладающий минимальной длиной среди каталитических РНК. Каталитический мотив головка молотка был обнаружен в РНК некоторых вирусов растений. Оказалось, что для аутосплайсинга мРНК этих вирусов необходима нуклеотидная последовательность, вторичная структура которой напоминает но форме головку молотка и состоит из трех двуспиральных участков, два из которых фланкируют расщепляемую фосфодиэфирную связь, и двух высококонсервативных одноцепочечных последовательностей. В общем виде структура головки молотка представлена на рис. Рис. Вторичная структура каталитического домена головка молотка. Н любой нуклеотид, кроме . Стрелкой указан сайт расщепления. В дальнейшем каталитический мотив головка молотка был обнаружен не только в РНК вирусов растений, но и у земноводных, насекомых и плоских червей, а также получен независимо методом селекции i vi ,. Это дает основания рассматривать рибозим головка молотка как наиболее эволюционно древнюю каталитическую РНК. При сравнительно небольшой длине олигонуклеотидной цепи рибозим головка молотка обладает высокой каталитической активностью. Сочетание этих свойств делает его удобным объектом изучения и основой для создания искусственных рибозимов. II


применения в качестве селективных агентов для направленного расщепления РНК будет посвящен данный обзор литературы. Начало конструированию искусственных рибозимов головка молотка, способных осуществлять трднсрасщепление, т. РНК, было положено в работе О. ШепЬеск . Авторы предложили разделить рибозим на два отдельных частично комплементарных олигомера таким образом, чтобы энзим и субстрат образовывали стебли I и II так называемый III формат рис. Рис. Разделение каталитического мотива головка молотка на рибозим и субстрат, предложенное О. ЫепЬеск . Жирным шрифтом выделены консервативные рибо нуклеотиды. Стрелкой указан сайт расщепления. I и III формат, а дуплекс и петля II входят в состав рибозима. З.
3 5
. ЧДЛЛ,
Рибозим
Рис. Разделение домена головка молотка на рибозим и субстрат способом, предложенным У Нае1оАГ и . НасЬ . Нуклеотиды рибозима и РНКсубстрата пронумерованы согласно общепринятой номенклатуре . Стрелкой указан сайт расщепления. Перенос большинства консервативных рибонуклеотидов в рибозимную часть значительно смягчил требования к выбору РНКсубсгратов. Это позволило перейти от нескольких уникальных примеров каталитических последовательностей к универсальным рибозимам, способным расщеплять широкий спектр последовательностей РНК, и стало импульсом для огромного числа работ, посвященных созданию рибозимов головка молотка для направленного расщепления РНК. Необходимо отметить, что при разделении головки молотка на рибозимную и субстратную части данным способом рибозим утратил петлю, закрывавшую дуплекс I ср. З. Недавно было обнаружено, что петля I играет более важную роль в функционировании рибозима, чем считалось ранее взаимодействие петель I и II стабилизирует Уформу рибозима, образование которой необходимо для расщепления , поэтому расщепление фосфодиэфирной связи в РНК в составе гдорибозимов происходит быстрее, чем в случае иишсрибозимов .