Исследование ренатурации рекомбинантных белков : На примере человеческих α-фактора некроза опухолей, Υ-интерферона, интерлейкина-3 и биотехнологических предшественников инсулина

• Автор: Тихонов, Роман Владимирович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 117 с.

1. Ренатурация белков в биотехнологии Обзор литературы.

1.1. Ренатурация белков i viv в К i.

1.2. Ренатурация белков i vi.

1.3. Структура и биологическое действие

аФНО, ИЛ3, уИФН и инсулина.

2. Обсуждение результатов.

2.1. Факторы, влияющие на ренатурацию белка i vi.

2.2. Разработка методов выделения рекомбинантных

белков из биомассы трансформированных клеток .i.

2.2.1. Выделение и очистка аФНО дикого и мутантного типов.

2.2.2. Выделение уИФН и ИЛ3. 2.2.3 Выделение ГБпредшественников

инсулина в виде сульфонатных производных.
2.3. Влияние внутримолекулярных факторов.
2.4. Влияние параметров реакционной среды.
2.4.1. Условия образования дисульфидной связи.
2.4.2. Концентрация белка и температура реакции.
2.4.3. среды.
2.4.4. Природа реакционной среды.
2.5. Результаты оптимизации ренатурации.
2.6. Разработка схем получения рекомбинантных белков.
3. Экспериментальная часть.
3.1. Материалы.
3.2. Оборудование.
3.3. Методы.
3.3.1. Общие методы.
3.3.2. Получение аФНО.
3.3.3. Получение ИЛ3.
3.3.4. Получение уИФН.
3.3.5. Получение ГБ предшественников инсулина.
4. Выводы.
5. Приложения.
5.1. Приложение 1.
5.2. Приложение 2.
5.3. Приложение 3.
5.4. Приложение 4.
6. Список цитированной литературы.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
уИФН
ГБ
кд
БЭБ РАСЕ
иоВЭЖХ
схфактор некроза опухолей
уинтерферон
интерлейкин
гибридный белок, содержащий аминокислотную последовательность проинсулина, биотехнологический предшественник инсулина человека
ГБ Бсульфонат ББОзб
круговой дихроизм
додецилсульфат натрия
гельэлектрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия
обращеннофазная ВЭЖХ
ионообменная ВЭЖХ
эксклюзионная ВЭЖХ
Введение


Поиск условий ренатурации для конкретного белка, тесным образом связанный с изучением ее закономерностей, представляет сложную многомерную задачу, решаемую путем постепенного подбора условий среды и оптимизации большого количества факторов. Единых методов ренатурации рекомбинантных белков на сегодняшний день не существует, однако, на основе изученных закономерностей, систематизации и обобщения данных о различных белках представляется реальной разработка унифицированных подходов к поиску условий ренатурации таких белков, в том числе и не существующих в природе. Проблема ренатурации не единственная трудность, возникающая при получении терапевтических белков. Как и любое лекарственное средство, такой препарат должен облачать достаточной стабильностью в условиях хранения и применения, а также минимальными побочными эффектами. Природные белки белки дикого типа зачастую не соответствуют этим требованиям. Нестабильность белка при хранении, слишком короткий период полураспада препарата в кровотоке, наличие в полипептидной цепи нескольких сайтов рецепторного узнавания, необходимых для проявления белком присущих ему биологических функций, но нежелательных с точки зрения его терапевтической пригодности вот самые распространенные причины, сдерживающие широкое применение тех или иных белковых препаратов. Не рассматривая биологические аспекты применения мутантных белков, необходимо заметить, что любые изменения в аминокислотной последовательности белка могут повлиять на его ренатурацию. Объекты исследования настоящей работы перспективные и уже применяющиеся в клинической практике белки. Это человеческий рекомбинантный афактор некроза опухолей аФНО и его мутантный аналог Н с пониженной токсичностью, интерлейкин3 ИЛ3, уинтерферон уИФН и его мутантный аналог Е7СБС с повышенной стабильностью, а также четыре гибридных белка ГБ биотехнологические предшественники инсулина человека с различными лидерными пептидами. В работе изучались факторы, влияющие на ренатурацию этих белков с целью поиска ее закономерностей и оптимальных условий на основе исследованных факторов, с конечной целью разработки эффективных методов получения высокоочищсиных биологически активных субстанций этих белков. Рснатурация белков в биотехнологии. Проблема укладки полипелтидной цепи ренатурация, фолдинг в нативную пространственную структуру одна из основных в современной биохимии, биоорганической химии, молекулярной биологии, медицине. Основные аспекты проблемы фолдинга белка первоначально были сформулированы в виде парадокса Левинталя 3,4, заключающегося в том, что теоретически белок не может за короткое время сложиться в нативную структуру, статистически перебирая все возможные конформации, тогда как фолдинг белка в природе происходит за секунды или минуты. Недавно было осознано, что парадокс Левинталя не является парадоксом, если при рассмотрении процесса фолдинга принимать во внимание энергетический компонент баланс свободной энергии белковой молекулы. Более того, недавно разработанные микроскопические физические модели фолдинга хотя и очень упрощенные разрешают этот парадокс 5. Эти исследования изменили взгляд на путь фолдинга белков, сделав его нормальной физикохимической проблемой, а не таинственным явлением, самые основы которого неизвестны. Новейшие открытия в области фолдинга белковой молекулы не означают отказа от классического понимания этого процесса. Современный статистический и физикохимический подход к проблеме фолдинга белка следует рассматривать как неоклассический в том смысле, что он расширяет и дополняет известное понимание, а не вырабатывает новые фундаментальные основы. Процесс фолдинга остается как четко определенная цепь событий, следующих друг за другом 3. Каждое событие, с современной точки зрения, может быть интерпретировано как переход из одного фазового состояния в другое 5. Природа этих превращений и фазовых состояний изучается на основе теоретических упрошенных моделей и подтверждается или опровергается экспериментом, который является лучшим судьей в споре различных теорий.