Фоторецепторный аннексин А4: обнаружение, локализация и функциональные характеристики

• Автор: Зерний, Евгений Юрьевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 147 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

АННЕКСИНЫ СЕМЕЙСТВО Са2ФОСФОЛИПИДСВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ.

1. Са2связывающие белки в регуляции зрительной трансдукции

1.1. Общая схема зрительной трансдукции.

1.2. Регуляция зрительной трансдукции

2. Структура и общие свойства аннексинов.

2.1. Номенклатура

2.2. Тканевая и внутриклеточная локализация

2.3. Гены и первичная структура

2.4. Вторичная и третичная структуры.

2.5. Димеризация и четвертичная структура
2.6. Связывание с мембранами и агрегация клеточных мембран.
2.7. Взаимодействие с лигандами нелипидной природы.
3. Функциональная активность аннексинов
3.1. Участие в транспорте и организации клеточных мембран
3.2. Регуляция проводимости и образование ионных каналов.
3.3. Участие в клеточной пролиферации и дифференцировке
3.4. Аннексины в крови и межклеточном пространстве.
4. Аннексинопатии
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Реактивы
2. Выделение НСП из сетчаток быка и получение экстракта НСП
3. Очистка аннексина А4 р из НСП и печени быка.
4. Получение отмытых мочевиной фоторецепторных мембран.
5. Получение поликлональных моноспецифических антител против аннексина А4 из печени быка.
6. Получение фракции белков НСП, способных Са2зависимым образом взаимодействовать с иммобилизованным аннексином А
7. Определение концентрации белков
8. БОБэлектрофорез в полиакриламидном геле ПААТ
9. Иммуноблотганг.
. Масспктрометрический анализ белковых препаратов.
. Иммунофлуоресцентное окрашивание срезов сетчатки и печени
. Связывание аннексина А4 с отмытыми мочевиной фоторецепторными мембранами.
. Агрегация отмытых мочевиной фоторецепторных мембран в присутствии аннексина А
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Выделение и очистка фоторецепторного белка р и его идентификация как аннексина А
1.1. Получение и характеристика фракции фоторецепторных Са2зависимых белков.
1.2. Выделение и очистка фоторецепторного белка с кажущейся молекулярной массой кДа р
1.3. Доказательство способности гомогенного р взаимодействовать с фоторецепторными мембранами Са2зависимым образом
1.4. Идентификация р как аннексина А4.
1.5. Изучение локализации аннексина А4 в сетчатке быка
2. Изучение функциональных свойств фоторецепторного аннексина А
2.1. Взаимодействие аннексина А4 с фоторецепторными мембранами
2.1.1. Са2ьзависимое связывание аннексина А4 с фоторецепторными мембранами
2.1.2. 2п2зависимое связывание аннексина А4 с фоторецепторными мембранами.
2.2. Аннексии А4зависимая агрегация фоторецепторных мембран
2.2.1. Аннексии А4зависимая агрегация фоторецепторных мембран в присутствии ионов кальция
2.2.2. Аннексии А4зависимая агрегация фоторецепторных мембран в
присутствии ионов цинка
3. Поиск потенциальной белковой мишени мишеней для аннексина А4 в фоторецепторной клетке.
3.1. Выявление растворимых белков НСП, связывающихся с иммобилизованным аннексином А4 Са2зависимым образом
3.2. Идентификация потенциальных белковых мишеней аннексина А
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Интенсивные исследования аннексинов, проводимые в последние годы, позволили обнаружить эти белки в клетках различных типов и выявить их участие в самых разнообразных биологических процессах от транспорта и организации клеточных мембран до передачи внутриклеточных сигналов. Тем не менее, конкретная функция аннексинов в каждом случае остается не установленной. Исследования аннексинов в фоторецепторных клетках позвоночных животных до сих пор не проводились. В настоящей работе мы впервые показали присутствие одного из представителей семейства аннексинов, аннексина А4, в наружных сегментах фоторецепторных клеток быка, и получили данные, указывающие на функцию аннексина А4 в этом виде клеток. Са2связывающие белки в регуляции зрительной трансдукцнк. Общая схема зрительной трансдукции. Сенсорную функцию в сетчатке выполняют фоторецепторные клетки, палочки и колбочки, представляющие собой высокоспециализированные нейроны. Рис. Схемы строении сетчатки позвоночных А и отдельной палочки Б. Оба типа фоторецепторов это длинные, узкие клетки, свое название они получили изза формы их наружных сегментов, которые у палочек тонкие, цилиндрические, у колбочек значительно более утолщенные рис. I. Наружный сегмент часть фоторецепторной клетки, которая своим окончанием обращена к наружной части глаза, в нем присутствуют зрительный пигмент и катаболическис ферменты, необходимые этой структуре для выполнения функции световой антенны 1,2. Далее предметом нашего рассмотрения будут только палочки сетчатки, которые изучены намного лучше, чем колбочки. Наружный сегмент палочки НСП представляет собой стопку из сотен или даже тысяч так называемых фоторецепторных дисков. Фоторецепторные диски образуются у основания НСП как впячивание плазматической мембраны, далее диски как бы отпочковываются от плазматической мембраны, превращаясь в замкнутые структуры, и становятся независимыми как от нее, так и друг от друга. Тем самым наружная поверхность плазматической мембраны оказывается внутренней поверхностью дисков, а виутридисковое пространство ведет свое происхождение от внеклеточного пространства 1,2. На диски приходится подавляющая часть массы НСП, в то время как на плазматическую мембрану всего 3. Около общего белка НСП составляет интегральный мембранный белок родопсин 4. Только два белка присутствуют в НСП в количестве, превышающем 1 копию на 0 молекул родопсина, это трансдуцин и аррестин. Еще белков, включая сСМРфосфодиэстеразу ФДЭ, представлены 1 копиями на молекул родопсина. Молярное соотношение ФДЭ трансдуцин родопсин выглядит как 1 0 5. Рассмотрим общую схему зрительной тансдукции рис. Свет, воздействуя на зрительный пигмент родопсин, переводит его в
Рис. Общая схема молекулярных механизмов зрительной грансдукнии. Т трансдуцин фосфодиэстераза родопсинкиназа аррестин гуанилатциклаза. НСП. Далее зрительный сигнал передается через нейроны высшего порядка и по зрительному нерву в соответствующие отделы головного мозга 1,2. Первый шаг процесса зрительной трансдукции поглощение кванта света родопсином, трансмембранным зрительным рецептором, и переход этого белка в фотоактивированное состояние. Родопсин представляет собой гликопротеид с молекулярной массой кДа, который состоит из 8 аминокислотных остатков 6 и хромофорной группы, исретиналя 7. Белковая часть родопсина, опсин, характеризуется наличием 7 гидрофобных участков из аминокислотных остатков каждый, которые образуют 7 трансмембранных ацепей 8. Шиффа с 8аминогруппой боковой цепи остатка лизина6 в седьмой трансмембранной аспирали белка 7,8. Наибольшую важность для возникновения фоторецепторного ответа представляет один из интермедиатов фотолиза родопсина метародопсин II, появление которого при комнатной температуре наблюдается примерно через 3 сек после поглощения родопсином кванта света 9. Именно метародопсин II выступает в роли активатора следующего белка зрительного каскада, белка трансдуцина, молекула которого состоит из трех субъединиц альфа, бета и гамма Та, Тр и Ту с молекулярными массами, соответственно, , и 8 кДа .