Фаговый дисплей мышиных миниантител: получение и использование

• Автор: Ламан, Александр Георгиевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 107 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Классификация и доменная организация иммуноглобулинов.

1.2. Клонирование иммуноглобулинов и их фрагментов.

1.2.1. Экспрессия иммуноглобулинов и их фрагментов в гетерологичиых системах.

1.3. Создание комбинаторных библиотек антител.

1.3.1. Метод фагового дисплея. Основные принципы.

1.3.2. Строение нитевидного фага и его жизненный цикл.

1.3.3. Геном фага Я и его продукты.

1.3.4. Векторы для фагового дисплея.

1.3.5. Векторы на основе нитевидных фагов, используемые для создания библиотек мнниантител.
1.3.6. Другие векторы, используемые в методе фагового дисплея.
1.4. Библиотеки миниантитсл. Конструирование и практическое использование.
1.4.1. Конструирование библиотек, основанных на комбинации синтетических СЭЮ.
1.4.2. Применение бсБу.
ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
2.1. Конструирование библиотеки миниантител.
2.1.1. Амплификация фрагментов генов вариабельных областей
иммуноглобулинов.
2.1.2. Клонирование объединенных фрагментов легких и тяжелых цепей в Е.соН.
2.2.1. Селекция миниантител к гранулоцитарному колонийстимулирующему фактору.
2.2.2. Создание тестсистемы для количественного определения ОСЭР.
2.3. Выделение миниантител.
2.3.1. Выделение секретируемых миниантител иммуноаффинной хроматографией.
2.3.2. Выделение секретируемых миниантител ионообменной хроматографией.
2.4. Получение и характеристика миниантител к траисзеатину.
2.4.1. Синтез конъюгатов трансзеатина.
2.4.2. Селекция миниантител к трансзеатину.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
3.1. Олигонуклеотиды и праймеры.
3.2. Выделение мононуклеарных клеток.
3.3. Выделение РНК.
3.4. Выделение ДНК
3.5. Синтез кДНК.
3.6. Амплификация ДНК генов вариабельных областей иммуноглобулинов.
3.7. Получение линкера.
3.8. Сборка и амплификация объединенных фрагментов тяжелых и легких
цепей 1.
3.9. Клонирование бсРу.
3 Амплификация библиотеки бсРу.
3 Биотинилированис вСЭР.
3 Селекция вСЭРспсцифичных клонов.
3 Первичный анализ селектированной библиотеки методом иммуноскрининга на чашках.
3 Клонирование последовательности ДНК, кодирующей антигенную
детерминанту 1Ь2 для антител ЛНКБ2.
3 Синтез конъюгата биотина с трансзеатином.
3 Синтез конъюгатов зеатинрибозида с ВБА, овальбумином и
аминогексилссфарозой.
3 Селекция клонов, специфичных к трансзеатину.
3 Выделение секретируемых миниантител методом иммуноаффинной
хроматографии.
3 Выделение секретируемых миниантител методом ионообменной
хроматографии.
3 Определение констант аффинности миниантител.
ВЫВОДЫ.
Список литературы


Широчайшим образом антитела используются в настоящее время для анализа субпопуляционного состава клеток крови метод проточной цитометрии, что позволяет характеризовать иммунный статус организма. С помощью изотопномеченных антител проводится локализация в организме очагов опухолевого роста. В терапевтических целях антитела применяются для нейтрализации токсинов. Разрабатываются подходы к использованию антител в терапии злокачественных опухолей. Антитела находят применение в научных исследованиях для выделения иммуноаффинная хроматография и характеристики биомолекул. Исторически первым источником антител была сыворотка иммунных животных и человека. Получаемые таким образом антитела содержат набор иммуноглобулинов различных классов и подклассов, специфично узнающих свой антиген. Различные антитела сыворотки узнают несколько участков эпитопов антигена. Таким образом, сыворотка полиспецифична, что в ряде случаев является недостатком. К достоинствам моноклональных антител можно отнести высокую специфичность, возможность получения их в больших количествах и одинаковой специфичности. К недостаткам можно отнести то, что технология получения моноклональных антител разработана для мыши и крысы и является трудно применимой в случае антител человека, в то время как для терапевтических нужд требуются именно человеческие иммуноглобулины. Затруднения возникают и в тех случаях, когда иммунизация животных по какойлибо причине невозможна или не удается обойти толерантность к антигену. Для разрешения этой проблемы в настоящее время предложены методы молекулярного клонирования фрагментов генов антител. Одним из таких методов является техника фагового дисплея антител. В году было показано, что антиген связывающие фрагменты iiv, , представленные на поверхности нитевидного фага, могут быть отобраны на иммобилизованном антигене , . Основной идеей метода является создание комбинаторной библиотеки, в которой вариабельные участки легких и тяжелых ценен иммуноглобулинов соединены случайным образом и представлены па поверхности бактериофага. Каждый бактериофаг, как и Влимфоцит, экспрессирует антитело единственной специфичности. При достаточно большом размере библиотеки репертуар вариабельных участков будет сравним с репертуаром антител в организме. Возможность отбора антител i vi, минуя стадии иммунизации животных. Отсутствие необходимости использования лабораторных животных и поддержания . Время получения индивидуальных клоиовпродуцентов мипнантитсл составляет дней, по сравнению с несколькими месяцами в случае гибридомной технологии. Относительная простота получения антител и их низкая себестоимость. Возможность создания гибридных молекул с маркерными белками за короткое время. Возможность получения антител к аутоантигенам и слабоиммуногснным соединениям. С целью решения стоящих перед Институтом задач нам представлялось актуальным создание комбинаторно библиотеки миниаитител мыши, в частности, получение па ее основе бсРу к интересующим нас антигенам граиулоцитариому колонисстимулирующему фактору человека вСЭР и природному фитогормону трапсзсатилу. ССБР цптокнн, стимулирующий рост гранулоцитов и активирующий нейтрофилы Сусп, . Он представляет собой гликозилироваииый полипептид с молекулярной массой кДа. СБР применяется в онкологии для восстановления числа нейтрофилов при лейкопении, вызванной радио или химиотерапией. Для анализа ОСБР в процессе производства и клинического применения необходимы тестсистемы, причем наиболее удобными в настоящее время являются иммунохимичсские тестсистемы на основе антител. Трансзсатии это одни из ключевых фнтогормонов, ответственных за рост и развитие растений. Несмотря на большой объем данных о роли трансзсатииа в регуляции деления и днфферешшровки клеток, механизм действия этого вещества до сих пор недостаточно изучен. Использование антител, направленных против трансзеатина, может позволить прояснить молекулярные аспекты его функционирования. Создание представительной библиотеки фагового дисплея мышиных миииантитсл. Проверка качества полученной библиотеки на примере получения фагмидиых клонов, . СБР и гаптсну транс зсатииу.