Поиск природных лигандов протонактивируемых рецепторов

• Автор: Осмаков, Дмитрий Игоревич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 106 с. : ил.

Оглавление
1. Введение
Цель и задачи работы
2. Обзор литературы
2.1. Введение
2.2. Структура канала AS1C
2.3. Электрофизиологические свойства и распределение в тканях ASIC каналов
2.4. Модуляторы активности ASIC каналов
2.4.1. Ди- и поливалентные катионы
2.4.2. Низкомолекулярные компоненты
2.4.3. Модуляторы пептидной природы
2.5. Роль каналов AS1C в физиологических и патологических процессах
2.5.1. Участие в физиологических процессах в органах ЦНС
2.5.2. Роль каналов ASIC в нейродегенеративных заболеваниях
2.5.3. Роль AS1C3 в физиологических и патологических процессах
2.6. Заключение
3. Материалы и методы исследования
3.1. Материалы и оборудование
3.1.1. Реактивы и материалы
3.1.2. Биологический материал и животные
3.1.3. Бактериальные штаммы и плазмидные векторы
3.1.4. Среды для выращивания бактерий
3.1.5. Оборудование
3.2. Методы
3.2.1. Обработка биологического материала
3.2.2. Выделение активных компонентов из биологических смесей
3.2.2.1. Выделение из экстрактов растений
3.2.2.2. Выделение из экстракта морской анемоны
3.2.2.3. Выделение из ядов, полученных механической стимуляцией морских
анемон
3.2.3. Масс-спектрометрический (МС) анализ
3.2.4. УФ-спектрофотометрия

3.2.5. Установление первичной структуры активных соединений
3.2.5.1. Алкилирование полипептидных компонентов
3.2.5.2. Определение А-концевой аминокислотной последовательности
3.2.5.3. Определение С-концевой аминокислотной последовательности
3.2.6. ЯМР-спектроскопия
3.2.7. Измерение биологической активности
3.2.7.1. Электрофизиологические измерения
3.2.7.2. Экспрессия генов, кодирующих каналы AS1C, в ооцитах Xenopus laevis
3.2.7.3. Измерение модулирующей активности на токи каналов ASICla, ASlClb,
ASIC2a и AS1C3 (общий протокол)
3.2.7.4. Измерение модулирующей активности на быструю составляющую тока

3.2.7.5. Измерение модулирующей активности на медленную составляющую тока

3.2.8. Тестирование анальгетической активности
3.2.8.1. Испытание анальгетической активности в тесте тепловой
гиперчувствительности
3.2.8.2. Испытание анальгетической активности в тесте кислотной стимуляции боли
3.2.9. Получение кДНК из морских анемон
3.2.10. 3’и 5’RACE-ПЦР
3.2.11. Получение рекомбинантного аналога полипептида
3.2.11.1. Синтез гена полипептида с помощью ПЦР
3.2.11.2. Агарозный гель-электрофорез
3.2.11.3. Получение векторов
3.2.11.4. Приготовление компетентных клеток
3.2.11.5. Трансформация компетентных клеток электропорацией
3.2.11.6. Отбор клонов, содержащих плазмиду со вставкой интересующего гена
3.2.11.7. Экспрессия клонированных генов
3.2.11.8. Выделение гибридных белков. Аффинная хроматография
3.2.11.9. Белковый электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ)
3.2.11.10. Гидролиз гибридных белков. Очистка рекомбинантных полипептидов

3.2.12. Биоинформационные методы
4. Результаты исследования и их обсуждение
4.1. Выделение и установление структуры лигандов канала ASIC
4.1.1. Полипептид из спиртового экстракта анемоны Heteractis crispa
4.1.2. Полипептиды из яда морской анемоны Utricina grebelnyi
4.1.3. Низкомолекулярный компонент из чабреца (Thymus armeniacus)
4.2. Рекомбинантный аналог пептида Ugr
4.3. Действие лигандов на ASIC3 канал, экспрессированный в ооцитах X. laevis
4.3.1. Электрофизиологическое тестирование пептида я-AnmTX Her 1 b-
4.3.2. Электрофизиологическое тестирование пептида Ugr
4.3.3. Сравнение пептидов л-AnmTX Hcr lb-1 и Ugr 9-1 с известными пептидными
лигандами ASIC каналов
4.3.4. Электрофизиологическое тестирование севанола
4.4. Анальгетические эффекты лигандов ASIC каналов в тестах in vivo
4.4.1. Анальгетический эффект севанола и recUgr 9-1 в тесте тепловой
гиперчувствительности
4.4.2. Анальгетический эффект севанола и recUgr 9-1 в модели «уксусные корчи»..
5. Заключение
6. Выводы
7. Список сокращений
8. Список литературы:

некоторых метаболитов. Например, аяюЗ-/- мыши проявляли большую защищенность от развивающейся с возрастом непереносимости глюкозы, а также повышенную чувствительность к инсулину. Сходные результаты были получены и при введении мышам дикого типа ингибитора АРЕТх2, что лишний раз доказывало участие А81СЗ в развитии возрастной непереносимости глюкозы и устойчивости к инсулину [197].
А81СЗ были обнаружены в каротидном теле (воспринимают сигналы при гипоксемии, гиперкапнии и ацидозе, и играют важную роль в кардиореспираторной регуляции), где они участвуют в передаче сигналов хеморецепторам посредством активации при снижении pH [198]. Также АБГСЗ каналы участвуют в процессах хемовосприятия С02 клетками эпителия пищевода и дыхательной системы [199-200].
Участие в других физиологических процессах
А81СЗ присутствуют во внутреннем сегменте палочковидных светочувствительных клеток, а также в горизонтальных и некоторых амакриновых клетках в сетчатке, где данные каналы принимают участие в их функционировании и сохранности. Тот факт, что передача сигнала нейронам в сетчатке сильно зависит от pH внеклеточной среды [201], а также эксперименты с инактивацией АБГСЗ у мышей являются свидетельствами важной роли, которую данные каналы играют в поддержании целостности сетчатки. При этом инактивация А81СЗ приводила к негативным эффектам, схожим с таковыми при глаукоме и при хронической ишемии, связанными с дефектами во внутреннем сегменте «палочек» [202].
А81СЗ каналы были обнаружены у крыс в вестибулярном аппарате [203], гипоталамусе [175] и надзрительном ядре [204], однако их роль в данных органах еще не выяснена.
Участие в процессе восприятия боли
Хорошо известно, что в периферических органах в результате воспалительного процесса, инфекции, ишемии, гематоме, а также при длительной физической нагрузке pH внеклеточной среды в данной области может понижаться до значений <7 [8].
Представленность в тканях и свойства А81СЗ каналов делают их привлекательной мишенью для исследований в качестве объектов, вносящих существенный вклад в процесс восприятия боли при понижении pH среды.