Расположение кодонов мРНК в А-, Р- и Е-участках по данным аффинной модификации рибосом человека аналогами мРНК - производными олигорибонуклеотидов с фотоактивируемой группой на остатке гетероциклического основания

• Автор: Демешкина, Наталья Александровна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 133 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. Структурнофункциональная организация рибосомы в процессе элонгации Обзор литературы

1.1. Структурнофункциональная организация бактериальной рибосомы

1.1.1. Общее строение рибосомы

1.1.2. мРНКсвязывающий центр

1.1.3. Расположение молекул тРНК в А, Р и Еучастках рибосомы

1.1.4. Декодирование м РНК

1.1.4.1. Структурные основы взаимодействия кодонспецифичной тРНК в Аучастке

1.1.4.2. Роль фактора элонгации Ти

1.1.5. Образование пептидной связи
1.1.6. Траислокация
1.1.6.1. Модели транслокации
1.1.6.2. Роль фактора
1.1.7. Механизмы действия некоторых антибиотиков
1.1.8. Сравнение данных по структурной организации активных центров, полученных методом аффинной модификации и РСА
1.1.8.1. мРНКсвязывающий центр
1.1.8.2. тРНКсвязывающие участки
1.2. Некоторые аспекты структурнофункциональной организации рибосом эукариот
1.2.1. Структурнофункциональная организация рибосом дрожжей
1.2.2. Структурнофункциональная организация рибосом высших эукариот
1.2.3. мРНКсвязывающий центр рибосом человека
1.3. Заключение
ГЛАВА 2. Расположение кодонов мРНК в А, Р и Еучастках по данным аффинной модификации рибосом человека аналогами мРНК производными олнгорибонуклеотидов с фотоактивируемой группой на остатке гетероциклического основания
2.1. Результаты
2.1.1. Фотоактивируемые производные олнгорибонуклеотидов
2.1.2. Модельные комплексы рибосом с аналогами мРНК
2.1.3. Анализ сшивок аналогов мРНК
2.1.3.1. Анаиз сшивок с рРНК
2.1.3.2. Анализ сшивок с тРНК
2.1.4. Определение участков рРНК, содержащих нуклеотиды, сшитые с аналогами
2.1.4.1. Определение участка сшивки аналога мРНК IV с Зконцевой
последовательностью рРНК
2.1.4.2. Определение участка сшивки аналога мРНК V с Зконцевой
последовательностью рРНК
2.1.5. Определение нуклеотидов рРНК, сшитых с аналогами мРНК
2.1.6. Определение белков, сшитых с аналогами мРНК 1, и III
2.2. Обсуждение результатов модификации рибосом фотоактивируемыми
производными олнгорибонуклеотидов и
2.2.1. Взаимодействие производного с рРНК в составе
комплекса с 8 рибосомой, образованного в отсутствие тРНК
2.2.2. А, Р и Еучастки мРНКсвязывающего центра 8 рибосомы
2.2.3. Сшивки производного рииАСилиииАии с тРНК
2.2.4. Соотнесение данных по аффинной модификации Б рибосом человека реакционноспособными аналогами мРНК со структурой мРНКсвязывающего
центра рибосом бактерий
2.3. Заключение
ГЛАВА 3. Экспериментальная часть
3.1. Материалы
3.2. Выделение рибосомных Б и Б субчастиц из плаценты человека
3.3. Синтез фотоактивируемых производных олнгорибонуклеотидов, несущих
перфторфенилазидогруппу на атоме 7 остатка гуанина
3.4. Введение радиоактивной метки на 5конец
3.5. Гидролиз РНКазой Т1
3.6. Дефосфорилирование тРНК
3.7. Получение комплексов 8 рибосом с аналогами мРНК в присутствии тРНК
3.8. Фотоаффинная модификация Э рибосом производными риЛЮии
и рЦиАСиАиииАии
3.9. Разделение модифицированных Б рибосом на субчастицы
3 Выделение рРНК из 8 рибосом
3 Установление района 8 рРНК, содержащего участок сшивки с аналогом
мРНК, с помощью гидролиза РНКазой Н
3 Выделение Зконцевого фрагмента рРНК, содержащего сайт сшивки с
производным 3 0, и введение радиоактивной метки по 3концу этого фрагмента
3 Ограниченный щелочной гидролиз и гидролиз РНКазой 2
3 Определение модифицированных нуклеотидов в рРНК с помощью метода
обратной транскрипции
3 Определение модифицированных рибосомных белков с помощью одномерного
гельэлектрофореза
3 Гидролиз протеиназой К и РНКазой А
3 Определение модифицированных рибосомных белков с помощью двумерного
гсльэлсктофореза
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Во всех организмах синтез белка трансляция происходит на рибосоме рибонуклеопротеидном комплексе, состоящем из малой и большой субчастиц. Малая субчастица отвечает за процесс декодирования мРНК, а большая субчастица за образование пептидной связи и выход синтезированной полипептидной цепи из рибосомы. Взаимодействие субчастиц друг с другом, осуществляемое за счет межсубъединичных контактов, обеспечивает координирование событий, происходящих на каждой из субчастиц, и лежит в основе процесса транслокации, в ходе которого происходит синхронное перемещение молекул тРНК и мРНК на рибосоме. Кроме мРНК и тРНК, рибосома связывает множество белковых факторов и ГТФ. Для понимания молекулярных механизмов функционирования рибосомы необходимо располагать информацией о ее детальном строении. В настоящем обзоре рассмотрены данные по структурнофункциональной организации рибосом бактерий на стадии удлинения полипептидной цепи элонгации трансляции, полученные за последние 7 лет с помощью методов РСА и криоЭМ. Особое внимание в обзоре уделено сравнению данных по структурной организации мРНК и тРНКсвязываюших центров рибосом прокариот, полученных с помощью РСА и метода аффинной модификации. Кроме того, в обзоре представлены данные криоЭМ рибосом эукариот и данные по изучению мРНКсвязывающего центра рибосом человека, полученные с помощью метода аффинной модификации. Структурнофункциональная организация бактериальной рибосомы. Общее строение рибосомы. Первые данные о пространственной организации рибосомных субчастиц и рибосомы в целом в частности, рибосомы . С помощью методов иммуноэлектрон ной микроскопии и нейтронного рассеяния определено расположение большинства белков на рибосоме. Использование метода криоЭМ позволило описать пространственное строение рибосом бактерий на более детальном уровне 9. К сегодняшнему дню максимальный уровень разрешения, который удалось достичь при определении пространственной структуры рибосомы . ЭМ, составляет . А . При таком уровне разрешения видны отдельные спирали рРНК и их контакты друг с другом и рибосомными белками, однако более тонкие детали строения рибосомы установить невозможно. Метод РСА позволяет определить общую пространственную организацию сложных надмолекулярных структур на атомном уровне. На сегодняшний день с помощью РСА определены пространственные структуры не только свободных и субчастиц , , но и рибосомы в комплексе с молекулами тРНК и мРНК 2,,. Согласно этим структурам общая пространственная организация рРНК и белков субчастиц и рибосомы такова, что РНК формирует сердцевину частицы, тогда как основная масса белков расположена на ее поверхности рис. Рибосомные белки имеют в основном глобулярную форму, хотя многие из них содержат протяженные домены, которые могут достаточно глубоко проникать в структуру рРНК, стабилизируя тем самым субчастицу в целом. Подобные стабилизирующие взаимодействия широко распространены среди спиралей рРНК и осуществляются в основном за счет остатков аденозина ,. Три структурных домена субчастицы головка, тело и платформа образованы 3главным, 5 и центральным доменами вторичной структуры рРНК малой субчастицы рРНК и соединены между собой в районе шеи единичным спиральным элементом Н рРНК рис. Такое соединение доменов обеспечивает их относительную автономность относительно друг друга и, как следствие, подвижность этих доменов в составе рибосомы. Напротив, шесть доменов вторичной структуры рРНК большой субчастицы рРНК взаимно переплетены в пространстве, образуя плотный кор . Особенности строения малой и большой субчастиц могут служить объяснением различий в их функциях, выполняемых в процессе трансляции. Рис. Кристаллические структуры бактериальной рибосомы и ее субчастнц . А, Р и Е молекулы тРНК, связанные в А, Р и Еучастках рибосомы, соответственно. Рис. Структура рРНК . Схематическое изображение вторичной структуры рРНК использована нумерация спиралей в рРНК . Здомен и голубым Змалый домен б пространственная организация спиралей рРНК в составе субчастицы представлена контактная поверхность субчастицы.