Получение и использование магнитных частиц для стабилизации белков в водно-органических смесях : На прим. моноклон. антител и α-химотрипсина

• Автор: Киселев, Максим Всеволодович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 107 с.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Белки в водно-органических смесях
1.1.1 Неспецифические взаимодействие фермента и 6 органического растворителя
1.1.2 Специфические взаимодействия белков с 12 органическими растворителями
1.2. Методы стабилизации белков к инактивации в водно
органических системах
1.2.1 Иммобилизация белков
1.3 Магнитные носители для иммобилизации белков
1.3.1 Магнитные материалы
1.3.2 Способы синтеза мелкодисперсных магнитных частиц
1.4 Физико-химические характеристики взаимодействия 26 белок-лиганд
1.4.1 Способы расчета параметров связывания
1.4.2 Анализ графиков в координатах Скетчарда
1.4.3 Анализ нелинейных графиков в координатах Скетчарда
1.5 Характеристика циклоспоринов
1.5.1. Общие сведения о цикпоспоринах
1.5.2 Фармакодинамика циклоспорина А
1.5.3 Фармакокинетика циклоспорина А
1.5.4 Метаболизм и элиминирование циклоспорина А
1.5.5 Методы анализа циклоспоринов
2. ВЫВОДЫ ИЗ ОБЗОРА ЛИТЕРАТУРЫ И ПОСТАНОВКА 44 ЗАДАЧИ
3. ВЫБОР ОБЪЕКТОВ
4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
4.1. Материалы
4.1.1 Реактивы
4.1.2 Приборы и материалы

4.2 Методы
4.2.1 Получение суспензии мелкодисперсного магнетита
4.2.2 Получение покрытий магнитных частиц
4.2.3 Рентгенофазовый анализ
4.2.4 Интерференционная микроскопия
4.2.5 Квазиупругое рассеяние лазерного света
4.2.6 Активация полимерных покрытий магнитных частиц
4.2.7 Иммобилизация антител на частицах
4.2.8 Определение активности иммобилизованного а
химотрипсина
4.2.9 Активация циклоспорина С
4.2.10 Получение конъюгата активированного циклоспорина 54 С с флуоресцеин- гексаметиледиамином
4.2.11 Получение конъюгата активированного циклоспорина 55 С с БСА
4.2.12 Методика проведения твердофазного 55 иммуноферментного анализа
4.2.13 Методика проведения иммунофлуоресцентного
анализа с использованием магнитных частиц
4.2.14 Экстракция циклоспорина А из крови пациентов
4.2.15 Определение концентрации циклоспорина А в
экстракте из крови пациентов
5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
5.1 Получение мелкодисперсного магнетита
5.2 Получение покрытий магнитных частиц
5.2.1 Гидроксиапатитное покрытие
5.2.2 Покрытие из окиси титана (IV)
5.2.3 Получение ПЭИ покрытия
5.2.4 Покрытие из поперечно-сшитого ПАА
5.3 Активация полимерных покрытий магнитных частиц
5.4. Иммобилизация белков на поверхности частиц
5.4.1 Иммобилизация на неорганических покрытиях
5.4.2 Иммобилизация на полимерных покрытиях

5.5. Свойства а-химотрипсина, иммобилизованного на /4 магнитных частицах
5.6. Стабильность иммобилизованного а-химотрипсина в 76 водно-этанольных смесях
5.7 Свойства антител, иммобилизованных на магнитных
частицах
5.8. Разработка метода иммуноанализа циклоспорина А в
этанольных экстрактах крови пациентов
5.8.1 Получение конъюгатов для иммуноанализа
5.8.2.Выбор концентрации органической компоненты
5.8.3 Подбор условий экстракции циклоспорина А из 91 образцов крови
5.8.4 Построение градуировочной зависимости
5.8.5 Сравнение с существующими методами
6. ВЫВОДЫ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

специфическими рецепторами на цитоплазматической мембране лимфоцитов. Раздраженные клетки синтезируют и секретируют в окружающую ткань 11_-2, кпекой-мишенью для которого являются Т-киллерные лимфоциты. При взаимодействии 11_-2 с рецептором Т-киллеров через фосфатидилинозитолтрифосфатный каскад активируется фермент протеинкиназа С. Последний, действуя на белки-гистоны генома клетки, запускает синтез цитотоксических белков. Цитотоксические белки секретируются Т-киллерами в окружающую ткань и поражают клеточные антигены, нарушая целостность цитоплазматической мембраны [128]. Для циклоспорина А клеткой-мишенью являются Т-хелперные лимфоциты. Нарушить Т-хелперную иммунную реакцию можно: (1) блокируя взаимодействие 11_-1 с
рецепторами Т-хелперных клеток, (2) нарушая синтез 11_-1, макрофагами или распознавание антигена макрофагами; (3) - нарушая секрецию И-2; 2- способствуя подавлению синтеза 11.-2 других участников лимфокинного каскада - 11.-3, И-4, у-интерферона (1РЫ-у), фактора некроза опухолей а (ТЫРа) и колониестимулирующего фактора гранулоцитов (вМ-СЭР) [129]. Циклоспорин А нарушает синтез 11.-2, воздействуя на геном лимфоцита. После проникновения в клетку циклоспорин А специфически связывается с белками-посредниками -цикпофиллинами - (СУР), образуя прочный комплекс. Образовавшийся комплекс ингибирует ферментативную активность обеих субъединиц (СЫА и СУВ) Са2+-калмодулин зависимой фосфатазы кальцинейрина, ответственную за перенос сигнала о связывании Т- клеточного рецептора с антигеном к ядру клетки. В результате ингибирования кальцийнейрин не дефосфорилирует антиген-зависимые факторы транскрипции гена 11.-2 - -АТ и ЫР-кВ, которые, в свою очередь, оказываются неспособными активировать транскрипцию гена интерлейкина-2 [129].
Таким образом циклоспорин А прерывает нормальную Т-кпеточно-опосредованную иммунную реакцию.
Циклоспорин А особенно эффективен, когда антигеном являются клетки трансплантанта. Известно, что острое раннее отторжение