Конструирование реагентов для направленного расщепления рибонуклеиновых кислот

• Автор: Сильников, Владимир Николаевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 313 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ
I. КАТАЛИЗАТОРЫ ГИДРОЛИТИЧЕСКОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ СВЯЗИ РО В НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТАХ И МОДЕЛЬНЫХ СУБСТРАТАХ ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Конструирование реагентов для направленного расщепления нуклеиновых кислот

1.2. Гидролитический механизм расщепления Р0 связей

1.2.1. Гидролитическое расщепление фосфодиэфирных связей в РНК

1.3. Расщепление Р0 связей различных субстратов природными биокатализаторами

1.3.1. Расщепление РО связей в каталитических центрах ферментов

1.3.2. Расщепление фосфодиэфирных связей в присутствии НКзимов

1.4. Расщепление РО связей под воздействием неприродных агентов

1.4.1. Расщепление РО связей ионами металлов и металлокомплексами

1.4.2. Расщепление РО связей аминосоединениями и короткими пептидами

1.5. Моделирование каталитических центров металлозависимых ферментов, гидролизующих Р0 связи в различных субстратах
1.6. Моделирование каталитических центров металлонезависимых рибонуклеаз
ф 1.7. Реагенты, расщепляющие РНК по определенным участкам
структуры
1.7.1. Конъюгаты на основе полициклических соединений
1.7.2. Конъюгаты на основе поликатионов
1.8. Сверхспецифичные рибонуклеазы на основе конъюгатов олигонуклеотидов с каталитическими группами
1.9. Методы синтеза олигонукпеотидных конъюгатов, содержащих реакционноспособные группы
Заключение
И. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
III. КОНСТРУИРОВАНИЕ ОРГАНИЧЕСКИХ КАТАЛИЗАТОРОВ ГИДРОЛИТИЧЕСКОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ РНК. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
III. I. Синтетические катализаторы на основе полициклических
ароматических соединений
III. 1.1. Конструирование и синтез РНКазомиметиков на основе полициклических ароматических соединений III. 1.2. Гидролитическая активность РНКазомиметиков на основе полициклических ароматических соединений
.2. Синтетические катализаторы на основе поликатионных соединений
1.2.1. Конструирование и синтез РНКазомиметиков на основе коротких катионных пептидов и пептидоподобных молекул
1.2.2. Гидролитическая активность РНКазомиметиков на основе коротких катионных пептидов и
пептидоподобных молекул
Ш.2.3. Конструирование и синтез РНКазомиметиков на основе бисчетвертичных солей 1,4диазабицикло2.2.2октана
1.2.4. Гидролитическая активность РНКазомиметиков на основе четвертичных солей 1,4диазабицикло2.2.2октана. Зависимость гидролитической активности от строения
Ш.2.4.1. Сравнение рибонуклеазной активности соединений с различным доменным составом
III.2.4.2. Сравнение рибонуклеазной активности соединений с различными каталитическими группами Ш.2.4.3. Влияние количества положительных зарядов в РНКсвязывающем домене на эффективность расщепления РНК
1.2.4.4. Влияние длины линкера, связывающего катапитическую группу с диазабициклоокановым фрагментом, на эффективность расщепления фосфодиэфирных связей
Ш.2.4.5. Влияние строения алифатического остатка в РНКсвязывающем домене РНКазомиметиков на эффективность расщепления фосфодиэфирных связей Ш.З. Предполагаемый механизм гидролиза РНК химическими рибонуклеазами Ш.4. Высокоспецифичные катапизаторы расщепления РНК на основе конъюгатов олигонуклеотидов с РНКгидролизующими конструкциями
1.4.1. Синтез и свойства олигонуклеотидных конъюгатов,
содержащих каталитические группы, присоединенные к олигонуклеотидам через 5 или 3 концевые фосфамидные группы
Ш.4.2. Синтез и свойства олигонуклеотидных конъюгатов,
содержащих каталитические группы, присоединенные к олигонуклеотидам через 5 концевые фосфодиэфирные группы
Ш.4.3. Синтез и свойства олигонуклеотидных конъюгатов,
содержащих каталитические группы, присоединенные к 5 или 3концевым фосфамидным группам через промежуточные полициклические соединения Ш.4.4. Другие подходы к конструированию олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих каталитические группы Ш.4.4.1. Синтез и свойства олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих каталитические группы на основе дендримерных конструкций Ш.4.4.2. Конструирование конъюгатов, содержащих
каталитические группы в середине олигонукпеотидного адреса
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ЛИТЕРАТУРА
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
уАЬи
Аса Аа, А Аг Я Абп, Ы АБр, О1
Вг
СЬг
а
аи
СуБ, С
ИЫМР
Ех
С
аи, е
аденозин
4аминомасляная кислота ацетил
6аминокапроновая кислота
аргинин
аспарагин
аспарагиновая кислота
тетбутилокс и карбон ильная защитная группа
бензильная защитная группа
цитидин
бензилоксикарбонильная защитная группа 2циклогексиламиноэтансульфоновая кислота дезокси
дициклогексилкарбодииимид
дезоксиуридин
цистеин
4диметиламинопиридин дезоксирибонуклеозид монофосфат этилендиаминтетрауксусная кислота этил
2,4динитрофенильная защитная группа
гуанозин
глутамин
глутаминовая кислота
Употребляется только для записи аминокислотной последовательности пептидов однобуквенным кодом.
С1у, в НА
Н1Б
Ьеу
Ьуз, К Ме1т МеО2Тг Меи М РЬе, Е РИ3Р Ри Ру
БОБ
Тг
ТРБСМ
вэжх
ПААГ
глицин
гистамин
Ы2гидроксиэтилпиперазинГэтансульфоновая кислота
гистидин
имидазол
левулиновая кислота лизин
1метил имидазол
диметокситритильная защитная группа
метионин
фенилаланин
трифенилфосфин
пуриновый нуклеозид
пиримидиновый нуклеозид
дипиридилдисульфид
додецилсульфат натрия
три фтору ксусная кислота
2.4.6триизопропилбензолсульфокислота
2.4.6триизопропилбензолсульфохлорид уридин
высокоэффективная жидкостная хроматография ионообменная хроматография полиакриламидный гель трисгидроксиметиламинометан

Введение


Вторым важнейшим классом природных биокатализаторов являются НКзимы открытые сравнительно недавно природные катализаторы на основе нуклеиновых кислот. Известно также, что нуклеиновые кислоты деполимеризуются в присутствии антибиотиков природных соединений, отличающихся разнообразным строением и механизмом действия. Прогресс, достигнутый в области изучения строения и механизмов функционирования природных ферментов, гидролизующих РО связи в различных субстратах, нашел отражение в ряде обзоров, опубликованных в последние годы. Строение белковых катализаторов в основном определяется двадцатью аминокислотами. Наиболее часто в каталитических центрах рассматриваемых катализаторов встречаются аминокислотные остатки гистидина, лизина, аргинина, аспарагиновой и глутаминовой кислот и их амидов, а также гидроксилсодержащие аминокислоты. Са, , Со, , и
Очень часто каталитические центры различных гидролаз содержат два комплексообразующих домена, сформированных аминокислотными остатками i, , , , и одной из гидроксилсодержащих аминокислот или Туг. Расстояния между ионами металлов в активных центрах составляет . Кроме того, каталитические центры содержат одну или несколько таких аминокислот, как , , , i, . Функциональные группы этих аминокислот непосредственно не связаны с ионами металлов и выполняют роль дополнительных основных, кислотных или нуклеофильных катализаторов. На рис. I.4I. Значительно реже встречаются ферменты наиболее часто рибонуклеазы, активные центры которых не содержат ионов металлов. Примерами таких ферментов могут служить рибонуклеазы семейств А рис. Т рис. Рис. Рис. Строение каталитического центра пурпурной кислотной фосфатазы ЕС 3. Азп1 нвзга
ф

Аэр
Аэр
ф

О
Н Н1э
Рис. АБр
Рис. А ЕС 3
Рис. Строение каталитического центра рибонуклеази Т ЕС 3. Рис. Пример расщепления фосфодиэфирной связи в РНК по механизму внутримолекулярной переэтерификации с участием кислотноосновного катализа. В отличие от гидролиза С0 связей, расщепление Р0 связей с участием нуклеофильного катализа встречается очень редко. Примером
ферментов, функционирующих по такому механизму, могут служить фосфолипазы О из различных источников рис. Рис. Предполагаемый механизм гидролиза фосфодиэфирных связей фосфолипазой Б из в. Ыi. При гидролитическом расщеплении Р0 связей природными ферментами в качестве атакующей нуклеофильной частицы выступает молекула воды, однако в ряде случаев это могут быть алкоксильные группы. Примером таких групп может служить 2гидроксильная группа рибозы и ОНгруппа гидроксилсодержащих аминокислот. Значительно реже в качестве нуклеофильной частицы выступает БНгруппа цистеина. Наиболее вероятный механизм гидролиза фосфоэфиров , аналог механизма 5д2, предполагает, что в качестве атакуемой частицы выступает атом фосфора. При этом реакция протекает через образование отрицательно заряженного интермедиата с пентакоординированным атомом фосфора рис. В. Стабилизация промежуточного состояния происходит за счет делокализации отрицательного заряда как на фосфате, так и на кислороде уходящей группы. В работе на основе анализа аминокислотных остатков, входящих в активные центры гидролаз фосфогидролаз и родственных им пептидаз, были выявлены четыре типа доменов, ответственных за активацию нуклеофильных частиц молекулы воды или гидроксильной группы и четыре типа доменов, ответственных за повышение электрофильности атома фосфора. Металлокомплексы с ионами или Мп
4. Металлокомплексы с ионами Ъа , Со и 1 . II. III. IV. Металлокомплексы 2, Мп2. Разделение на две независимые группы комплексов 3, 4 и III, IV по типу входящих в их состав ионов металлов с нашей точки зрения условно. Повидимому, более правильно говорить о двух типах комплексов по типу формирующих их лигандов в целом электронейтральные комплексы, сформированные преимущественно с участием карбоксильных групп и положительно заряженные комплексы, сформированные с участием преимущественно электронейтральных лигандов. Ро л в
V . Н . Рис. Примеры различных нуклеофильных частиц и вариантов их активации в каталитических центрах некоторых РНКДНКгидролизующих ферментов.