Функциональная роль неканонических белковых факторов р50 и РТВ в инициации трансляции у млекопитающих

• Автор: Писарев, Андрей Владимирович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 102 с. : ил.

Содержание.

Список сокращений

и Введение.

Обзор литературы

Глава 1. Инициация трансляции у эукариот

1.1 Механизмы инициации трансляции .

1.1.1 Сканирующая модель.

1.1.2 Внутренняя инициация трансляции.

1.2 Канонические факторы инициации трансляции у эукариот

1.2.1 Факторы, участвующие в образовании 4 8 предынициаторного комплекса

I3
.
I4.
I4.
1.2.2 Факторы, участвующие в образовании комплекса
I5.
1.3 Неканонические трансдействующие факторы
в инициации трансляции.
РТВ.
гяРНП Е1Е2 и К.
Р .
аутоантиген
1.4 Общая модель инициации трансляции у эукариот
Глава 2. Метод тоупринта в изучении сборки инициаторного
комплекса из индивидуальных компонентов
Результаты и обсуждение
Р в инициации трансляции
1. р влияет на связывание 4 рибосомной субчастицы с инициаторным кодоном в сборке предынициаторного комплекса из очищенных компонентов i vi.
2. р способен стимулировать образование аберрантного
4 8 комплекса на 5конце мРНК.
3. Способность р стимулировать образование предынициаторного комплекса из очищенных компонентов при низких отношениях рмРНК не является универсальным свойством мРНКсвязывающих белков
4. р связывается с сахарофосфатным остовом мРНК, проявляя
предпочтение к последовательностям, содержащим полностью неспаренные нуклеотидные основания
5. Связывание всего нескольких молекул р на молекулу рглобиновой мРНК достаточно для стимуляции образования
4 8 предынициаторного комплекса
6. р менеджер мРНКбелковых взаимодействий в мРНП
4 млекопитающих.
РТВ активный участник инициации трансляции на Iэлементе РНК вируса энцефаломиокардита
1. РТВ значительно усиливает сборку инициаторного комплекса на РНК ВЭМК из очищенных компонентов i vi
2. РТВ проявляет свойства РНКшаперона.7
3. Функция РТВ в Iопосредованной инициации трансляции на
РНК ряда пикорнавирусов специфична, но не распространяется на все пикорнавирусы.
Материалы и методы
1. Реактивы и материалы
2. Плазмидные конструкции
3. Генноинженерные манипуляции..
4. Получение РНКтранскриптов
5. Трансляция в лизате ретикулоцитов кролика.
6. Реконструкция инициаторных комплексов
из очищенных компонентов
6.1. Выделение рибосомных субчастиц
и факторов инициации.
6.2. Аминоацилирование инициаторной тРНК
6.3. Собственно сборка инициаторных комплексов.
6.4. Тоупринт
7. Центрифугирование комплексов в сахарозном градиенте.
8. Зондирование вторичной структуры мРНК.
9. Иммуноблоттинганализ.
. Ультрафиолетовые сшивки.
. Количественная обработка результатов
Выводы. .
Список литературы


По интенсивности сигнала тоупринта в сравнении с суммарной интенсивностью сигналов в дорожке можно оценивать эффективность сборки инициаторного комплекса. А точно известный набор используемых в сборке факторов дает возможность исследовать механизмы инициации трансляции. Метод реконструкции инициирующих комплексов помимо перечисленных преимуществ ещ и совершенно незаменим при исследовании трансляционного аппарата млекопитающих, поскольку в данном случае использование генетических методов крайне затруднено. Помимо канонических факторов инициации трансляции, для активности ряда матриц в трансляции необходимы дополнительные белковые факторы, которые регулируют клеточную активность в развитии клетки, делении и апоптозе. Такие неканонические факторы инициации трансляции специфичны в трансляции на определнной стадии клеточного цикла, специфичны для клеток тех или иных тканей, а также отвечают на характерный стресс. Есть лишь общие соображения, касающиеся функциональной роли таких белков в клетке при трансляции, механизм же их действия доподлинно не известен. По направленности действия в инициации трансляции есть специфические и общие неканонические белковые факторы. Например, РАВР и р связываются с большинством или даже со всеми видами мРНК и в целом контролируют белковый синтез. Р является наиболее широко представленным белком и неактивных, и активных полисомальных глобиновых мРНП, хотя последние содержат его в два раза меньше в расчте на молекулу РНК. Переходы мРНК из неактивного в активное состояние и обратно сопровождаются изменением содержания р в составе мРНП. РТВ, Ьааутоантиген, ипг, полиСсвязывающие белки РСВР1 и РСВР2, ЬпИМРК и другие, в отличие от р, являются специфическими неканоническими белковыми факторами, и их функциональная роль в инициации трансляции проявляется лишь для ряда определнных матриц. РТВ, в частности, требуется для образования Э комплекса с 1НЕ8элементами РНК ряда пикорнавирусов и с клеточной мРНК АраМ, продукт которой вовлечн в регуляцию клеточного апоптоза. Обладая навыками реконструкции инициирующих комплексов из очищенных и охарактеризованных компонентов в сочетании с техникой тоупринта, мы поставили своей целью в данной работе исследовать по одному примеру неканонического фактора того и другого класса р и РТВ и выявить их функциональную роль и механизм действия в инициации трансляции у млекопитающих. Обзор литературы. Глава 1. Инициация трансляции у эукариот. Механизмы инициации трансляции. Трансляция мРНК, иначе перевод информации, которую нест в себе мРНК, в белковую форму, является одним из основных этапов экспрессии генов. Белковый синтез приводит к появлению новых белков в клетке и замене тех, что успели подвергнутся деградации. Условием трансляции мРНК является образование на ней инициаторного комплекса. Кроме мРНК и рибосомных субчастиц в процессе сборки участвует, как правило, большое количество факторов инициации трансляции i iiii , , инициаторная аминоацилированная транспортная РНК i, молекулы АТР и 1. Инициаторным кодоном эукариотических мРНК является почти исключительно 2. Иногда используются , , и ряд других триплетов 3. Эукариотические мРНК в большинстве случаев кодируют один полипептид, т. При этом трансляция зачастую начинается с первого кодона или с одного из первых от 5 конца 4. Причина такого явления кроется в 5 конец зависимой, за некоторыми исключениями, инициации трансляции у эукариот. Нарушения правила моноцистронности среди клеточных матриц встречаются редко и чаще всего связаны либо с короткими рамками считывания, регулирующими инициацию трансляции главного полипептида, либо с альтернативной инициацией на нескольких , находящихся в одной рамке, что приводит к получению нескольких изоформ белка, различающихся по концу см. С другой стороны ряд вирусов использует бицистронные матрицы, кодирующие два полипептида например, вирус паралича сверчка V и вирус тли V. Анализ 5 концевых участков мРНК позволил установить консервативные области в окружении контексте стартового кодона 7.