Термостабильная ДНК-полимераза Archaeoglobus fulgidus и её свойства

• Автор: Чалов, Сергей Евгеньевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 138 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ТЕРМОСТАБИЛЬНЫЕ ДНКПОЛИМЕРАЗЫ СТРУКТУРНАЯ

ОРГАНИЗАЦИЯ, СВОЙСТВА И ПРАК ТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ

Обзор литературы.

1.1. Классификация ДНКполимераз.

1.2. Ферментативные активности ДНКполимераз.

1.2.1. Механизм полимеразной активности

1.2.2. экзонуклеазная активность.

1.2.3. экзонуклеазная активность.

1.3. Пронесенвность ДНКполимераз

1.4 Структурная организация и гомология ДНКполимераз семейства В

1 Структура ДНКполимераз семейства В
.1.1. ЧН2концевой домен.
1.4.1.2. Полимеразный домен
1 4.1.3. Домены пальцьГ.
1.4.1.4. экзонуклеазный домен
1.4.1.5. Совместное перемещение доменов
1.5. Термосгабильные ДНКполимеразы
1.5.1. Термостабильные ДНКполимеразы семейства А
1.5.2. Термосгабильные ДНКполимеразы из архебактерий семейства В
. Практическое использование термостабильных ДНКполимераз в
биотехнологии.
ГЛАВА 2. ТЕРМОСТАБИЛЬНАЯ ДНКПОЛИМЕРАЗ I V И ЕЕ СВОЙСТВА.
Обсуждение результатов.
2.1. Клонирование гена номер , США из генома
. iii.
2.2. Свойства рекомбинантной
2.2.1. Изучение экзонукясазной и полимеразной активностей ол
2.2.2. Мутагенез с заменой в белке Лнпол. аминокислотного остатка
2.2.3. Тсрмостабильность и температурный оптимум Лмсхопол
2.2.4. Влияние среды на ДНКполимеразную активность Дмехопол
2.2.5. Влияние одновалентных и двухвалентных катионов на полимеразные свойства Янехопол
2.2.6. Процессивность 4мехопол.
2.2.7. Амплификация ДНК Яехопол.,4пол
2.3. Структурнофункциональные исследования пол
2.3.1. Выбор учаегка для проведения мутагенеза гена пол.
2.3.2. Планирование и общая схема проведения мутагенеза.
2.3.3. Подготовка исходных компонентов для проведения мутагенеза
2.3.4. Мутагенез в белке Дмехоиол. для получения конструкции с уникальными
сайтами рестрикции V и Р7юг
2.3.5 Мутагенез с заменой в белке 1мехопол. аминокислотного остатка 3.
2.3.6. Мутагенез с заменой в белке .4ехопол. аминокислотного остатка 7.
2.3.7. Мутагенез с заменой в белке Дехопол. аминокислотного остатка
2.3.8. Изучение мутантных форм Лмехопол.
2.4. Получение и изучение свойств химерного белка Лнпол.
2.4.1. Конструирование химерного белка пол.
2.4 2 Изучение свойств химерного белка ТАипол.
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
Материалы и методы исследования.
3.1 Бактериальные штаммы и плазмиды.
3.2 Химические реагенты и ферменты
3.3 Приборы и аппараты
3.4 Общие методики
3.4.1. Трансформация клеток. i М
3.4.2. Амплификация гена пол
3.4.3. Идентификация Аипол. в штамме . i VI.
3.4.4. Выделение рекомбинантной пол.
3 4 5 Измерение активности Аипол
3 4.6. Исследование физикохимических характеристик 4иехопол.
3 4 7. Исследование термостабильности белков
3.4 8. Измерение экзонуклеазной активности
3.4 9. Тестирование ЗЗэндонуклеазной активности.
3 4 . Амплификация ДНК с использованием ТАипол , пол., Аиехопоп
3.4 Синтез фрагментов ДНК с помощью полимеразной цепной реакции ПЦР
3.4 Ферментативные реакции
3 4 Конструирование и отбор целевых мутантных плазмид, несущих точечные
замены аминокислотных остатков в белке Аипол
3 .4 Выделение и очистка плазмидной ДНК.
3.4. Препаративное выделение фрагментов ДНК из агарозного геля и
олигонуклеотидов из ПААГ
3.4 Секвенирование ДНК
3.4. Компьютерные программы для анализа нуклеотидных и аминокислотных
последовательностей.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
а.к. аминокислота, аминокислотный остаток Да Дальтон
ПААТ полиакриламидный гель п.н. пара нуклеотидов н о. нуклеотидное основание т.п.н. тысячи пар нуклеотидов среда .В среда ii ТЛЕ Трис ацетатный буфер ТХУ трихлоруксусная кислота Срт импульс в мин.
дитиотрейтол
РР, пирофосфат
додецилсульфат натрия
этилендиаминтетраацетат натрия
ПЦР полимеразная цепная реакция
мРНК матричная РНК
рРНК рибосомная РНК
дезоксирибонуклеозидтрифосфат
X, суммарная смесь дезоксирибонуклеозидтрифосфатов
ОЕгбо оптическая единица при длине волны 0 нм
ЭР эндонуклеаза рестрикции
РСА рентгеноструктурный анализ
i трисгидроксиметиламинометан
I 1изопропилтиогалактопиранозил
открытая рамка считывания
аипол. ген ДНКполимеразы Аи
Для структурных компонентов нуклеиновых кислот и их производных использованы символы и сокращенные обозначения, рекомендованные комиссией по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии ЩРАС и международного союза биохимиков ЩВ.
ВВЕДЕНИЕ


Однако невысокая проиессивность и точность копирования ДНК ограничивает возможность их применения в биотехнологии. В связи с этим представляется актуальным обнаружение новых термостабильных ферментов, клонирование их генов, изучение свойств, проведение белкового дизайна с целью получения рекомбинантных форм ферментов, обладающих измененными свойствами, расширяющими спектр их применения Кроме того, представляет шггерес изучение ДНКполимераз как компонентов репликашюнной системы архебактерий, являющихся обьектами, удобными для моделирования основных механизмов, действующих в бактериях и эукариотах. В настоящее время хорошо изучены ДНКполимеразы из архебактерий Р. М ii, Р. Т. ii, Т. А.и1ф1иь 3. На основе полного секвенирования геномов микроорганизмов М. Ш. А. Мих определен ряд генов, кодирующих ферменты, обеспечивающие синтез ДНК при достаточно высоких температурах 4, 5. Однако до настоящего времени не была выделена и соответствующим образом изучена ДНКполимераза из микроорганизма А. Шиз, не была исследована возможность се практического использования. Это и явилось причиной выбора этого фермента в качестве объекта исследования в данной работе. Цель данной работы состоит в исследовании структурной организации, свойств рекомбинантной ДНКполимеразы из термостабильного микроорганизма Агскаео1оЬт иМю и изучении возможности практического использования этого фермента. Выделение и изучение термостабильной Аипол. Анализ первичной структуры Аипол. Исследование основных харакгеристик и энзиматических свойств мутантных формЛипол. Создание химерного белка из Аипол. Тацпол. Работа содержит обзор литературы, посвященной изучению структурной организации, свойств ДНКполимераз, включая термостабильные, их практического применения. ГЛАВА I. ТЕРМОСТАБИЛЬНЫЕ ДНКПОЛИМЕРАЗЫ СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ, СВОЙСТВА И ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ. Полимеразы нуклсотидилтрансфсразы являются важнейшим классом ферментов, отвечающих за синтез нуклеиновых кислот из нуклеозидтрифосфатов. ЫТР Растущая в направлении цепь является комплементарной копией матричной цепи, поскольку способность сЮТР вступать в эту реакцию обусловлена их способностью образовывать канонические уотсонкриковские пары с соответствующими основаниями матричной цепи 6. Наличие двух типов нуклеиновых кислот обеспечивает возможность существования в природе четырех типов полимераз ДНКзависимых ДНКполимсраз, ДНКзависимых РНКполимераз, РНКзависимых ДНКполимераз и РНКзависимых РНКполимераз. ДНКполимеразы осуществляют матричнозависимую полимеризацию. Эти ферменты реплицируют ДНК с требуемой точностью, необходимой для поддержания стабильности генома, но делают достаточное количество мутаций для стимулирования и поддержания процесса эволюции. Кроме того, обнаружены полимеразы, осуществляющие безматричный синтез полинуклеотидов 7. Особенностью полинуклеотидзавнсимых полимераз является то, что они сочетают оба этих эволюционных подхода, существенно изменяя свою субстратную специфичность в соответствии с матрицей и проявляя при этом высокую селективность в каждом конкретном каталитическом цикле 8. Первые попытки объединения ДНКполимераз в группы были сделаны на основе биохимических свойств. Накопление информации о структуре генов ДНКполимераз позволило их классифицировать на основе сходства аминокислотных последовательностей. Первоначально было предложено подразделять ДНКпояимеразы на два семейства А и В. Классификация основана на подобии с ДНКполимеразой I . Пол1 подобные и сходстве с человеческой ДНКполимеразой а осподобные 9. В дальнейшем сравнение аминокислотных последовательностей различных полимераз позволило выделить четыре семейства этих ферментов А, В, С, X 1, , . Семейство А ДНКполимеразы, гомологичные продукту гена А, кодирующего ДНКполимеразу I . Семейство В ДНКполимеразы, гомологичные продукту гена , кодирующею ДНКполимеразу II . Семейство С ДНКполимеразы, гомологичные продукту гена роС, кодирующего ДНКполимеразу III а субъединицу . Семейство X ДНКполимеразы, гомологичные эукариотической ДНКполимеразе и терминальным трансферазам.