Нуклеозиды, модифицированные периленом и (фенилэтинил)пиренами по 2`-положению: синтез и спектральные свойства в составе флуоресцентных олигонуклеотидных зондов

• Автор: Астахова, Ирина Владимировна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 215 с. : ил.

Введение
Нуклеозиды, модифицированные по сахару флуоресцентными полициклическими углеводородами и другими метками синтез и свойства в составе олигонуклеотидов ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. Аналоги нуклеозндов, модифицированные пирснилметнльнон группой

II. Аналоги нуклеозндов, модифицированные через амидную, карбаматную и карбамндную связь

III. Аналоги нуклеозндов, модифицированные через тнольиую группу.

IV. Фупкционалнзнрованпые производные конформационноблокнрованных нуклеиновых

кислот ЦМА.

V Аналоги нуклеозндов, модифицированные через трназольную группу.

Заключение

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Синтез 1, 2 и 4фенилэтинилпиреновых 2карбаматных производных арабиноуридина и амидофосфитных реагентов на их основе свойства модифицированных олигонуклеотидов
1.1. Синтез 2 н 4этннилпирсиоп.
1.2. Получение арабнноиуклсозндов, меченных 1, 2 и 4фспилзтпшлппрснамн через 2 карбаматную связь
1.3. Спектральные свойства арабинонуклеозидов, меченных 1, 2 и 4фенплзтнлшрепам через 2карбаматную связь.
1.4. Синтез и свойства олигонуклеотидов, модифицированных остатками 1, 2 к 4фенилзтшлпнреов через 2карбаматную связь
1.4.1. Влияние 1РЕРу2карбаматной модификации на стабильность дуплексов.
1.4.2. Спектральные свойства модифицированных олигонуклеотидов и дуплексов.
1.5. Заключение
Глава 2. Синтез 1фенилэтинилпиреновых производных уридина и амидофосфитных реагентов на их основе спектральные свойства модифицированных олигонуклеотидов.
2.1. Синтез 4шрен1нлзтишлбснзнлурндинов.
2.2. Синтез олигонуклеотидов, модифицированных остатками мсти и пира
фСШЛЗТНЛПфСОВ через МСТНЛЫ1ЫИ линкер.
. Спектральные свойства конъюгатов, содержащих мета и т1фснлзтнилрсь,
присоединенные к урндниу через мстнльиь линкер
2.4. Заключение.
Глава 3. Синтез флуоресцентномеченных 2амино1А и амидофосфитных реагентов на их основе свойства модифицированных олигонуклеотидов
3.1. Синтез 2,Лгпсрнлс3.гмстл и 2Лгсрглеи3нлкарбошл2алноЧЛ и амидофосфитных реагентов на их основе свойства модифицированных
олигонуклеотидов
3.1.1. Синтез олигонуклеотидов, содержащих 2,Лгпсрилсн3илметнл н 2ЛЦпернлсн3илкарбопил2амниоЫЧА.
3.1.2. Влияние 2Лгпсрнлеи3нлмстил и 2ЛГпернлс3нлкарбоил2амниоиЧА на стабильность дуплексов
3.1.3. Свойства конъюгатов, содержащих 2,ЛЦпсрилс3плмстл2,амнноЬКА в качестве акцептора эиерпш для 2гЛгнрси1илмстнл2амииоА
3.1.4. Спектральные свойства ш i конъюгатов, содержащих 2ЛГпсрнлен3лкарбошл2аминоЬКА.
3.1.5. Спектральные своства зонда, модифицированного 2ЛЦперилеи3илкарбол2мнио
ЫЧА эксперименты в клеточно культуре
3.1.6 Заключение
3.2. Синтез Уфеннлзтшлпиремстил н 2,Лфснлзтнннлирспкарбонл 2амнпоЫтА и амидофосфитных реагента на их основе флуорофор присоединен к ЫЧА через арильную группу свойства модифицированных олигонуклеотидов
3.2.1. Синтез модифицированных олигонуклеотидов, содержащих 2,Лг
фсннлзтнннлпрсмстл и 2Лгфенилзтнлшрснкарбоинл2аминоЛЧА.
3.2.2. Влияние 2ЛЧфсилзтнлннрсиметил и 2Лгфснлзтилпнрекарбоннл2амо на стабильность дуплексов.
3.2.3. Спектральные свойства 2ЛЦфснлзттнлпиренмстнл и 2Лгфеилзтинлпрскарбопл2амиоЛЧА п составе олигонуклеотидов и дуплексов.
3.2.4. Заключение
3.3. Синтез длинноволновых красителей 2 Лгфеннлзтнглнрскарбоннл 2амнноЬХА и амидофосфитных реагентов на их основе флуорофор присосдинсп к ЫЧА через ппренонльную
группу свойства модифицированных олигонуклеотидов
.1. Синтез модифицированных олигонуклеотидов, содержащих 2Лг
фсизтнплпрснкарбоил2амнноЫЧА
.2. Влияние 2Лгфсннлэтинилпнренкарбош1л2амиио1лЧА на стабильность
дуплексов.
3.3.3. Спектральные и фотофнзичсскис свойства 2Лгфеиилзтиннлпнренкарбонл2аминоЛЧА в составе олигонуклеотидов.
3.3.3.1. Спектральные и фотофнзичсскис свойства моиоРЕРусЫМА в составе
олигонуклеотидов
3.3.3.2. Спектральные н фотофпзнчоскне свойства бисРЕРусЬХА в составе
олигонуклеотидов
3.3 Спектральные и фотофнзичсскис свойства трисРЕРусЫЧА в составе
олигонуклеотидов
3.3.3.4. Спектральные свойства дуплексов, содержащих РЕРусЬХА в двух комплементарных цепях
3.3.4. Заключение.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава Э1. Синтез и введение в олигонуклеотиды фуоресцентномеченных производных арабиоуридина.
Материалы и оборудование
Растворители
Реактивы
Оборудование
.1. Синтез 2 и 4фенилэтинилпиренов
.2. Синтез 1, 2 и 4фенилэтинилпиреновых 2карбаматных производных арабиноуридина, амидофосфитных реагентов на их основе получение модифицированных олигонуклеотидов.
Рис. Э Э. НМВС и НМССЯМР спектры модифицированных нуклеозндов
Получение модифицированных олигонуклеотидов.
Таблица Э1. 1 Мв синтезированных олигонуклеотидов
Расчет молярных коэффициентов поглощения и концентраций растворов модифицированных
олигонуклеотидов
Таблица Э2. Молярные коэффициенты поглощения для 1, 2 и 4фснилэтинилпиренов
Глава Э2. Синтез 1фенилэтинилпиреновых производных уридина, амидофосфитных реагентов на их основе и модифицированных
олигонуклеотидов.
Получение модифицированных олигонуклеотидов.
Таблица ЭЗ. I синтезированных олигонуклеотидов.I
Глава ЭЗ. Синтез и введение в олигонуклеотиды фуоресцентномеченных
производных 2 .
Материалы и оборудование
Растворители.
Реактивы.
Оборудование.
Методы.
.1. Синтез 2Лперилен3илметил и 2перилен3илкарбонил2амино и амидофосфитных реагентов на их основе.
.2. Синтез 2Лфенилэтинилпиренметил и 2Уфенилэтинилпиренкарбонил2амино и амидофосфитных реагентов на их основе.I
.3. Синтез моно, бис и трисфенилэтинилпиренов, йх присоединение по 2положению 2 и синтез амидофосфитных реагентов на основе полученных
конъюгатов.
Получение модифицированных олигонуклеотидов
Таблица Э4. I синтезированных олигонуклеотидов.
Таблица Э5. Молярные коэффициенты поглощения флуоресцентных нуклеотидов
Трансфекция клеток
Визуализация.
Приложение 1. Кривые плавления дуплексов олигонуклеотидов, содержащих 2пернлеи
i6i модификацию.
Приложение 2. Спектры поглощения и возбуждения модифицированных олигонуклеотидов и
дуплексов
Приложение 3. Спектры флуоресценции модифицированных олигонуклеотидов и дуплексов
Приложение 4. Спектры КД модифицированных олигонуклеотидов и дуплексов.
ВЫВОДЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Авторы высказали предположение, что в отсутствие связывание 6иуклеотидных субстратов происходит но одностадийному механизму, включающему только образование двойной спирали, а при прибавлении олигонуклеотид образует с комплементарным участком рибозима двойную Р1 спираль, а затем происходит сс включение в каталитическое ядро. В более поздней работе те же авторы описали исследование скоростей ассоциации и диссоциации комплекса пиренмеченого субстрата с . Был получен ряд термодинамических и кинетических параметров. Результатом проделанной работы стала дополнительная информация о снсцсфических третичных взаимодействиях, необходимых для связывания субстрата с каталитическим участком рибозима. II. При введении флуоресцентной метки в нуклеиновые кислоты посредством ковалентой связи часто используется гибкий, подвижный линкер между нуклеотидом и флуорохромом например, метиленовая группа. Однако иногда необходимо наличие жесткого спейссра между между остатком красителя и нуклеотидом, способствующего ограниченной подвижности флуорохрома в двойной спирали. Это способствует сохранению корреляции между нуклеиновой кислотой и флуорохромом при измерении анизотропии флуоресценции, и в некоторых случаях приводит к образованию более прочных дуплексов. Синтез производных нуклеозидов, в которых фиксированное расположение красителя достигается с помощью амидной связи, является одним из первых шагов в этом направлении. Помимо короткой длины, достоинствами амидного линкера являются химическая стабильность, жесткость и незаряжснность. Лгацилированне 5Озащищен но го производною 2амино2дезоксиуридина использовалось для синтеза модифицированных нуклеотидов ас, содержащих различные заместители в 2положении схема 3 . Для этого исходный нуклсозид вводили в реакцию с соответствующими карбоновыми кислотами в присутствии ОСС или ЕОС в качестве конденсирующих реагентов с последующим фосфитилированием полученных амидов ЗОас. Амидофосфитные реагенты ас использовались в твердофазном синтезе ДИК и ДНККБНК олигонуклеотидов, содержащих дополнительную модификацию . Схема 3. Показано, что введение от одной до трех модификаций ас в 9мерные олигодезоксирибоиуклсотиды заметно снижает их аффинность по отношению к комплементарным ДНК и РНК, в то время как дополнительное введение в те же последовательности трех мономеров значительно увеличивает термическую стабильность дуплексов с РНК. Наряду с использованием модифицирующих реагентов для введения метки в процессе синтеза олигодезоксирибонуклеотидов широко используется их постсинтстичсская модификация. Однако этот подход, как правило, требует предварительного введения в состав олигонуклеотида реакционноспособной группы. Синтез четырех РНКнуклеотидов, содержащих стандартные РНК основания и аминоэтокси2дезокси группу, описан в работе схема 4, приведен синтез на примере уридина. О, 2 СР. Л Л Л З МС. У а. Рга. ЛСГз юсго
Схема 4. Защищенный нукпеозид аллилировали по 2гидроксилу с последующим озонолизом двойной связи, восстановлением альдегидной группы, синтезом азида и реакцией Штаудингера РРЬ. НгО. Полученный амин защищали трифторацетилыюй групой, силильиую защиту удаляли обработкой ТВАР, после чего полученный нуклсозид диметокситритилировали и фосфитилировали. Амидофосфит и три РНК аналога, синтез которых осуществлен в работе , являются полезными реагентами для автоматизированного синтеза олигонуклеотидов, содержащих после удаления трифторацетильной защиты свободную аминогруппу для постсинтетической модификаци различными заместителями. В работе приведен синтез амидофосфитпого реагента на основе 2амино2дсзоксиуридина схема 5. Фотолиз
О. ЧЛ
2
ii
1. ЦОТЛ 0 V
Схема 5. Реагенты и условия i 4,5димстокси2нитробензилхлорформиат, I, ii i, I, . С использованием этого реагента были получены звенные олигомеры, содержащие 2аминогруппу, но которой далее были присоединены различные метки . По описанному выше методу был синтезирован ряд конъюгатов пентануклеотидов для исследований ингибирования экспрессии генов . ОНСО. Известно, что ингибирование происходит за счет гибридизации короткого нуклеотида с комплементарной последовательностью открытого иУ5комплекса, образованного ДНК и РНКполимеразой рис.