Полиферментные системы для получения модифицированных нуклеозидов

• Автор: Чувиковский, Дмитрий Вячеславович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 126 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений

Введение
Глава 1. Пуриновые и пиримидиновые нуклеозидфосфорилазы. Строение и механизм катализа. Литературный обзор

1.1 Общие сведения

1.2. Высокомолекулярные пуриннуклеозидфосфорилазы

1.2.1. Пространственная структура

1.2.2. Строение активного центра

1.2.3. Механизм катализа

1.3. Низкомолекулярные пуриннуклеозидфосфорилазы

1.3.1. Пространственная структура

1.3.2. Строение активного центра
1.3.3. Механизм катализа
1.4. Уридинфосфорилаза
1.4.1. Пространственная структура
1.4.2. Строение активного центра
1.4.3. Механизм катализа
1.5. Тимидинфосфорилаза . i и пиримидиннуклеозидфосфорилаза i i.
1.5.1. Пространственная структура
1.5.2. Строение активного центра
1.5.3. Механизм катализа
1.6. Заключение Глава 2. Получение системы для синтеза модифицированных нуклеозидов на
основе нуклеозидфосфорилаз . i.
2.1. Клонирование и экспрессия генов нуклеозидфосфорилаз . i
2.2. Выделение рекомбинантных ферментов
2.3. Определение константы Михаэлиса и константы равновесия рекомбинантных ферментов
2.4. Синтез модифицированных нуклеозидов с использованием рекомбинантных ферментов
2.4.1. Синтез кладрибина
2.4.2. Синтез рибавирина
2.4.3. Синтез флударабина
Глава 3. Материалы и методы
3.1. Реактивы
3.2. Ферменты .
3.3. Материалы
3.4. Препараты
3.5. Олигодезоксирибонуклеотиды
3.6. Бактериальные штаммы
3.7. Лабораторное оборудование
3.8. Буферы и растворы
3.9. Методы
3.9.1. Гельэлектрофорез
3.9.2. Трансформация клеток и отбор рекомбинантов
3.9.3. Выделение и очистка ДНК
3.9.4. Секвенирование плазмидной ДНК по методу Сейгера
3.9.5.Амплификация ДНК i vi
3.9.6. Молекулярное клонирование
3.9.7. Экспрессия генов. Анализ белковых продуктов
3.9.8. Выделение и очистка рекомбинантных ферментов
3.9.9. Определение кинетических параметров рекомбинантных ферментов
3.9 Синтез модифицированных нуклеозидов
Выводы
Благодарности
Список литературы


Глава 1. Пуриновые и пиримидиновые нуклеозидфосфорилазы. Строение и механизм катализа. Тимидинфосфорилаза . Заключение Глава 2. Клонирование и экспрессия генов нуклеозидфосфорилаз . Глава 3. Ферменты . Экспрессия генов. В настоящее время в химической и фармацевтической промышленностях находят все более широкое применение энзиматические реакции в качестве альтернативы традиционным методам органической химии. Одна из таких областей, в которой использование регио и стереоспецифичности ферментов позволяет избежать многостадийного органического синтеза это синтез модифицированных нуклеозидов. В силу своего сходства с природными нуклеозидами модифицированные аналоги могут избирательно ингибировать ферменты нуклеинового обмена, что используется для лечения различных вирусных и раковых заболеваний. Как правило, для синтеза модифицированных нуклеозидов используют нуклеозидфосфорилазы, выделяемые из бактерии . Вопросам строения и механизма катализа этих ферментов посвящен литературный обзор диссертации. Целью данной работы было получение полиферментных систем на основе рекомбинантных ферментов нуклеозидфосфорилаз ЫФ . ТФ, уридинфосфорилазы УФ и пуриннуклеозидфосфорилазы ПНФ Е. Глава 1. Пуриновые и пиримидиновые нуклеозидфосфорилазы. Строение н механизм катализа. Общие сведения. Биохимические процессы с участием нуклеотидов и нуклеозидов являются одними из самых фундаментальных в живой природе. В клетке биосинтез пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов может протекать по одному из двух путей 1 синтез v, в котором для синтеза нуклеозидов используются различные низкомолекулярные предшественники, в том числе и аминокислоты. Запасной путь позволяет клетке избежать энергетически дорогого синтеза нуклеозидов v, если доступны соответствующие предшественники. Кроме того, побочные продукты, высвобождаемые в запасном пути, могут служить источниками углерода, азота и энергии для клетки. Ключевую роль в запасном пути синтеза и регуляции внутриклеточного уровня свободных оснований и нуклеозидов играют ферменты нуклеозидфосфорилазы НФ 1. Эти ферменты катализируют обратимую реакцию фосфоролиза нуклеозидов, в ходе которой расщепляется гликозидная связь и образуется свободное основание и рибофуранозил1фосфат рибозо1фосфат рис. К этому классу ферментов относятся пуриннуклеозидфосфорилаза ПНФ КФ 2. УФ КФ 2. ТФ КФ 2. Кроме того, в некоторых низших организмах например, в i i вместо УФ и ТФ есть один фермент пиримидиннуклеозидфосфорилаза ПиНФ. Рис. Обратимая реакция, катализируемая нуклеозидфосфорилазами. В гетероциклическое основание . ОН i неорганический фосфат. В настоящее время изучение строения НФ, а также различия между НФ разных видов, привлекают большой интерес, в первую очередь связанный с поиском эффективных и специфических ингибиторов, которые могли бы быть полезными для лечения большого спектра заболеваний. В году было показано, что недостаток ПНФ у детей приводит к остановке развития Тклеток иммунной системы, вызванное накоплением в них , хотя Вклетки развиваются нормально 2. При таком специфическом проявлении ПНФнедостаточности специфические ингибиторы ПНФ могут быть полезны для лечения Тклеточных лимфом и лейкемий, Тклеточных аутоиммунных заболеваний, для подавления Тклеточного ответа после трансплантации 3. Низкую субстратную специфичность ПНФ . Раковые клетки, трансфецированные геном ПНФ . Фосфорилировать это соединение могут только те раковые клетки, в которых экспрессируется ген ПНФ Е. Иу поскольку ПНФ человека изза высокой специфичности не может фосфорилировать это соединение. Более того, образовавшийся 6метилпурнн способен проникать через клеточные мембраны и убивать соседние клетки. В последнее время появились публикации об успешном использовании другого лекарственного препарата флударабина для генной терапии раковых заболеваний 6.