Убиквитин-независимый протеолиз основного белка миелина и его роль в развитии экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита

• Автор: Кузина, Екатерина Сергеевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 113 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Протеасома
Структура и каталитические свойства протсасомы
Иммунопротеасома
Система убиквитинилирования. Убиквитин-зависимый и убиквитин-независимый протеолиз
Ингибиторы протеасомы
Презентация антигенов на молекулах главного комплекса гистосовместимости
Рассеянный склероз
Общая характеристика заболевания
Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит
Роль Т-клеток в развитии рассеянного склероза и ЕАЕ
Основной белок миелина
Роль протеасомы в развитии PC и ЕАЕ
Современные подходы к терапии рассеянного склероза
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование роли модификации МВР убиквитином в процессе деградации протеосомой
Внутриклеточная деградация МВР протеасомой в клетках млекопитающих
Протеолиз МВР 26S протеасомой in vitro
Изучение влияния заряда МВР на эффективность убиквитин-независимого протеолиза
Анализ физиологической значимости деградации МВР иммунопротеасомой
Изучение баланса протеасома-иммунопротеасома в ЦНС при развитии ЕАЕ
Локализация иммуносубъединиц иммунопротеасомы в структурах головного мозга на клеточном уровне
Сравнение спектров деградации МВР конститутивной протеасомой и иммунопротеасомой..
Исследование образования пептида МВР83.9о под действием иммунопротеасомы субъединичного состава piihighp5i,t"v
Свидетельство презентации пептида МВР8з_9о на МНС I и анализ цитотоксического действия МВР83.9о-специфических Т-клеток на олигодендроциты
Подходы к направленному подавлению гидролиза МВР протеасомой для терапии ЕАЕ
Использование малых интерферирующих РНК
Использование ингибиторов протеасомы
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Химические реактивы и сопутствующие материалы
Растворы
Работа с белками
Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле

Окрашивание ПААГ Кумасси синим R-2S0 с усилением контраста солью меди
Иммуноблоттинг
Электрофорез в неденатурирующих условиях
Иммунопреципитация
Работа с эукариотическими клетками
Методы работы с эукариотическими клетками линии НЕК и HeLa
Получение культуры зрелых олигодендроцитов
Получение активированных CD8+ Т-кпеток
Определение цитотоксической активности CD8+ Т-клеток
Иммуноцитохимическое окрашивание культур олигодендроцитов
Индукция ЕАЕ у экспериментальных мышей
Иммуногистохимия
Получение очищенного препарата протеасомы
Фракционирование протеасомы ультрацентрифугированием
Выделение, ацетилирование и деиминирование МВР
Убиквитинилирование in vitro
Протеолиз белков in vitro
Определение кинетических параметров ингибирования протеасомы
Методы масс-спектрометрического анализа
Тандемный хромато-масс-спектрометрический анализ
Масс-спектрометрический анализ нативного белка (Top-down)
Масс-спектрометрия с мониторингом множественных реакций
Поверхностный плазмонный резонанс
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
а.о. — аминокислотный остаток
Ат - антитело
АТФ - аденозинтрифосфат
АПК — антигенпредставляющая клетка
ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография
ГЭБ — гематоэнцефалический барьер
ДМСО — диметилсульфоксид
ИП - иммунопреципитация
кДа — килодальтон
ПААГ — полиакриламидный гель
PC - рассеянный склероз
ТКР — т-клеточный рецептор
ЦНС — центральная нервная система
ЭПР — эндоплазматический ретикулум
BSA — бычий сывороточный альбумин (bovine serum albumin)
СаМ - кальмодулин
ЕАЕ - экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (experimental autoimmune encephalomyelitis)
GA - глатирамера ацетат (glatiramer acetate)
HLA — лейкоцитарный антиген человека (Human Leucocyte Antigen)
IFN - интерферон
IgG - иммуноглобулины класса G
1L - интерлейкин

-Антитела к миелину
аити.)М(Хі?
Кровеносный сосуд
ІСАМ-1, УСАМ-1, Е-селектины ? количества
Внутренняя
мембрана
Активированные АПК (астроциты, микроглия, макрофаги)
Клетка-предшественник
олигодендроцита
В7-1, В
С028-* Иммунный ответ СПА-4-►Анергия .
Активированная / В клетка
Антиген
миелина
1ГО-у ,
Пролиферация
Миграция
Дифференциация
Ремиелинизация
Антитела
Макрофаг
Аутоиммунное
повреждение
Вызванное антителами повреждение
Олигодендроцит
Рисунок 9. Патогенез рассеянного склероза. Адаптировано из [92].
Помимо Т-клеток, в патогенезе РС принимают участие В-клетки, макрофаги, дендритные клетки, тучные клетки и микроглия. В-клетки могут служить антиген-презентирующими для аутореактивных Т-клеток, привлекать их в центральную нервную систему и производить костимуляцию [68]. Так, у больных детектируется повышенный