Взаимодействие репликативного белка А, флэп-эндонуклеазы-1 и ДНК-полимеразы β с фотореакционноспособными интермедиатами репликации и репарации ДНК

• Автор: Хлиманков, Денис Юрьевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 141 с. : ил

1.1. ДНКПОЛИМЕРАЗЫ РЕПЛИКАТИВНОЙ ВИЛКИ

1ЛЛ. ДНКПОЛИМЕРАЗА аПРАЙМАЗА.

1.1.1.1. Структура и функции.

1.1.1.2. Аффинная модификация ДНКполимеразы апраймазы

1.1.1.3. Аффинная модификация нрахшазного домена ДНКполимеразы апраймазы.

1.1.2. ДНКПОЛИМЕРАЗА

1.1.2.1. Структура и функции.

1.1.2.2. Аффинная модификация ДНКпояимеразы 5.

1.2. РЕПЛИКАТИВНЫЙ БЕЛОК А ЯРА.

1.2.1. Структура и функции.

1.2.2. Аффинная модификация ЯРА

1.3. ДРУГИЕ ДНКПОЛИМЕРАЗЫ И ФАКТОРЫ.
1.2.1. ДНКПОЛИМЕРАЗА Д
1.3.1.1. Структура и функции.
1.3.1.2. Аффинная модификация ДНКполииеразы
1.3.2. ЯДЕРНЫЙ АНТИГЕН ПРОЛИФЕРИРУЮЩИХ КЛЕТОК РСХА.
1.3.2.1. Структура и функции.
1.3.2.2. Аффинная модификация РСДА.
1.3.3. РЕПЛИКАТИВНЫЙ БЕЮК С НРС
1.3.3.1. Структура и функции.
1.3.3.2. Аффинная модификация ЛЕС
1.4. АФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ РЕПЛИКАТИВНЫХ БЕЛКОВ В МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ СИСТЕМАХ.
1.4.1. Аффинная модификация белков ядерного экстракта РИулагит роусерИаит.
1.4.2. Аффинная .модификация белков клеточного экстракта фибробпастовмыши.
1.5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2.1. МАТЕРИАЛЫ.
2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
ГЛАВА 3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЯРА, РЕ1Ч1 И ДНКПОЛИМЕРАЗЫ р С ФОТОРЕАКЦИОННОСПОСОБНЫМИ ИНТЕРМЕДИАТАМИ РЕПЛИКАЦИИ И РЕПАРАЦИИ ДНК РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РЕПЛИКАТИВНОГО БЕЛКА А И ДНКПОЛИМЕРАЗЫ р С ФОТОРЕАКЦИОННОСПОСОБНЫМИ ИНТЕРМЕДИАТАМИ РЕПЛИКАЦИИ И РЕПАРАЦИИ ДНК
3.1.1. Взаимодействие репликативного белка А и ДНКполимеразы 2 с одноцепочечными брешами длиной и нуклеотидных оснований
3.1.2. Взаимодействие репликативного белка А и ДНКполимеразы 3 с одноцепочечными брешаии длиной , 9 и 7 нуклеотидных оснований.
3.1.3. Взаимодействие репликативного белка А и ДНКполимеразы Д с ДНКдуппексами, содержащими одно2епочечные разрывы ники.
3.1.4. Взаимодействие репликативного фактора А и ДНКполимеразы 3 с ДНКдупчексами, содержащими свисающие концы фяэпы
3.1.5. Получение фотореакционноспособных ояигонукяеотидных дуплексов и их применение дня аффинной модификации ДНКсвязывающих белков. Взаимодействие репликативного белка А с двуцепочечной ДНК
3.2. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ФЛЭПЭНДОНУКЛЕАЗЫ1 И ДНКПОЛИМЕРАЗЫ Р С ФОТОРЕАКЦИОННОСПОСОБНЫМИ ИНТЕРМЕДИАТАМИ РЕПЛИКАЦИИ И РЕПАРАЦИИ ДНК.
3.2.1. Взаимодействие флэпэндонуклеазы1 и ДНКпояимеразы 1с 3 и 5концами праймеров.
3.2.2. Взаимодействие флэпэндонуклеазы1 и ДНКпопимеразы 3 с пиками и фяэпами
3.2.3. Аффинная модификация флэпэндонуклеазы1, репликативного белка А и ДНКполимеразы Зв
системе репарации, реконструированной из очищенных компонентов.
3.2.3.1. Исследование влияния репликативного белка А на активность ДНКполимеразы 3 в процессе длиннозаплаточной репарации оснований и взаимное влияние , 1, 3 на их взаимодействие с
3.2 4. Аффинная модификация флэпэндонуклеазы1, АРэндонуклеазы и ДНКполимеразы Зв многокомпонентной системе
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
С ПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
РСА рентгеноструктурный анализ
УФсвет ультрафиолетовый свет
ПААТ полиакриламидный гель
ЭФ электрофорез
8 ЭЯ додецилсулъфат натрия
ТЕМЕД Ы,Ы,Ымтетраэтилэтилендиамин
СА персульфат аммония
Трис трисгидроксимстиламиномстан
ЭД ГА эгилендиаминтетрауксусная кислота
ДНК нуклеиновая кислота
РНК дезоксирибонуклеиновая кислота
оцДНК одноцепочечная ДНК
ШТР дезоксиуридин5грифосфат
ВиАсАТР 2ибутиланилинос1АТР
ВиРИссОТР ААинбугшфенилсЮТР
БАВсСТР экзо2азидотсграфторбензамидоэтилдезоксицитидин5,трнфосфат РАРсиТР 5ЛгА4азидо2,5дифтор3хлорпиридин6ил3аминопропнониллшс3аминопропенил1 дезоксиуридинЗтрифосфат
ЫАВчИЛТ 5рт2ииро5азидобснзоиллшс3амииогропешл1 дезоксиуридин5трифосфат
РАВсШТР 5Л,г2,ЗД6тетрафтор4азидобензоилияс3амиюпропенилдезоксиуридин5трифосфат
РугсНТР чт4 1 пирснилэтилкарбоиил3аминорлспропснил1 2гдезоксиуридин5трифосфат.
агасИЛР 1Р арабинофуранозил5Е4азидос гирилурацил5трифосфат
ВгсИЛР 5бромдезоксиуридин5трифосфаг
биТР 5иоддезоксиуридин5трифосфат
с1ЫТР дезоксинуклеозид5трифосфат
АТР адеюзин5трифосфат
АРР аденозин5дифосфат
АМР аденозин5монофосфаг
сПТР тимидинЗтрифосфат
дидезокситимидин5,трифосфат
4тиотимидин5трифосфат
5утиотрифосфат
5дсзоксирибозофосфат
ДНКполимераза
а ДНКполимераза а
5 ДНКполимераза
Ро ДНКполимераза
ДНК ПК ДНКзависимая протеинкиназа
белок, связывающий одноцепочечную ДНК
репликативный белок А человека
репликативный белок С человека
1 флэпэндонуклеаза
ядерный антиген пролиферирующих клеток
АРЕ ануриноваяаииримидиновая эндонуклеаза
уратдилДНКгликозилаза
ХРА белок ксеродерма пигментозум А
X белок ксеродерма пигментозум
1 иолиАОРрибозополимсраза
пиридоксаль 5фосфат
ДНКсвязывающий домен
олигосахаридолигонсптидолигонуклеотидсвязывающий домен эксцизионная репарация нуклеотидов эксцизионная репарация оснований
ВВЕДЕНИЕ


Субъединица с молекулярной массой кДа участвует также в регуляции уровня ДНКполимеразы а в клетке, стимулируя синтез каталитического полипептида . С двумя малыми субъединицами связана праймазная активность . При этом субъединица кДа является каталитической и непосредственно осуществляет праймирование ДНК , а субъединица кДа участвует в связывании инициирующего пуринового нуклеотида и присоединении субъединицы р к ДНКполимеразе . ДНКполимераза а ингибируется афидиколином, сульфгидрильными реагентами, аналогами нуклеотидов и чем отличается от ДНКполимераз и с и не ингибируется . Оптимальная матрица для нее ДНК, активированная ДНКазой. Четырехсубъединичная ДНКполимераза а эффективно использует матрицы с высокой концентрацией праймера в случае матриц, содержащих протяженные однонитевые участки, эффективность ее значительно ниже. Это согласуется с данными о невысокой процессивности фермента в условиях п vi. При связывании с ираймерматричным комплексом ДНКполимераза а защищает от гидролиза ДНКазой I участок праймера размером 9 и. ДНКполимераза а образует функциональные комплексы с рядом ферментов и вспомогательных белков. Эти комплексы, по всей видимости, представляют собой фрагменты репликативного ансамбля клеток. В комплексе, осуществляющем репликацию лидирующей нити, ДНКполимераза связана с ДНКполимеразой 8, а в комплексе, синтезирующем запаздывающую цепь с ДНКполимеразой е. У эукариот оба комплекса связаны, вероятно, друг с другом в репликативной вилке подобно тому, как связаны холоферменты синтеза лидирующей и запаздывающей нити у прокариот. Об этом свидетельствует выделение из клеток человека комплексов, названных симтесомами и содержащих ДНКполимеразы а, б и 8, также ряд других репликативных белков, среди которых ДНКпраймаза, репликативный белок С , , полиАХРрибозополимераза и ДНКлигаза I . Репликативный белок А субъединицы , и кДа, который выполняет функцию белка в ядрах эукариот, также взаимодействует с ДНКполимеразой а, хотя сродство этих двух белков относительно невелико i М. Участок связывания полимеразы в субъединице р перекрывается с участком связывания большого Тантигена и локализован в концевой области. Кроме того, фермент взаимодействует с субъединицами р иили р . ДНКполимеразы а. Фосфорилирование , а также мутации в концевой области субъединицы р этого белка предотвращают взаимодействие и а и, следовательно, активацию ДНКполимеразы а. Количество ДНКполимеразы а может оставаться постоянным в течение клеточного цикла , или возрастать перед фазой , . Будучи комплексом, инициирующим репликацию ядерной ДНК, ДНКполимераза апраймаза является мишенью для многочисленных регуляторных факторов . Негативная регуляция ДНКполимеразы аираймазы в ходе клеточною цикла осуществляется с помощью фосфорилирования. Каталитическая субъединица р 0 и р являются фосфобелками, которые фосфорилируются преимущественно но остаткам , . Одной из характеристик опухолевых клеток является нарушение фосфорилирования субъединицы р 0 в клеточном цикле. Комплекс ДНКтголимераза апраймаза локализован в клеточном ядре. Хотя каталитическая субъединица р0 имеет сигнальную последовательность для ядерной локализации в Сконцевой области р0 из клеток млекопитающих или в концевой области р 0 из клеток дрожжей, транспорт р 0 в ядро происходит только в комплексе с субъединицей р и полностью зависит от нес . Для оценки сродства олигонуклеотидов различной длины и мономерных лигандов к матричному участку ДНКполимеразы а из плацены человека были проведены эксперименты по защите такими лигандами фермента от инактивации аффинным реагентом . В качестве аффинного реагента для модификации матричного участка полимеразы был использован декануклеотид, содержащий реакционноспособный остаток цисаквадигидроксидиаминоплатины II, брГ2рСРГ0МНз2ОНрТ7, поскольку в предыдущих работах было показано, что он избирательно модифицирует матричный участок ДНКполимеразы а из плаценты человека , . Олигонуклеотиды, этилированные по фосфатам в различных положениях олигонуклеотидной цепи, были использованы для анализа взимодейсгвий ДНКполимеразы а человека с матрицами и праймерами.