Модифицированные олигонуклеотиды, содержащие карбоксильную или альдегидную группу, и получение конъюгатов на их основе

• Автор: Качалова, Анна Владимировна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 123 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

2. ВВЕДЕНИЕ

3. ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ РЕАКЦИОННОСПОСОБНЫЕ

ЭЛЕКТРОФИЛЬНЫЕ ГРУППИРОВКИ Литературный обзор

3.1. Введение

3.2. Синтез олигонуклеотидов, содержащих бконцевую карбоксильную или альдегидную группу
3.3. Синтез олигонуклеотидов, содержащих Зконцевую карбоксильную или альдегидную группу
3.4. Синтез олигонуклеотидов, содержащих карбоксильную или альдегидную группу в середине цепи
3.4.1. Олигонуклеотиды, содержащие карбоксильную или альдегидную группу в гетероциклическом основании
3.4.2. Олигонуклеотиды, содержащие карбоксильную или альдегидную группу в составе звена ненукпеотидной природы
3.4.3. Олигонуклеотиды, содержащие альдегидную группу в составе апуринового сайта
3.4.4. Олигонуклеотиды, содержащие карбоксильную или альдегидную группу в 2положении углеводного фрагмента
3.5. Заключение
4. ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ
КАРБОКСИЛЬНУЮ ИЛИ АЛЬДЕГИДНУЮ ГРУППУ,
И ПОЛУЧЕНИЕ КОНЪЮГАТОВ НА ИХ ОСНОВЕ
Обсуждение результатов
4.1. Синтез модифицированных олигонуклеотидов,
содержащих остатки 0карбоксиметилрибофуранозиладенина или 0карбоксиметилр0рибофуранозилурацила
4.1.1. Синтез Замидофосфита диметокситритилгОметилоксикарбонилметилЛЛбензоиладенозина
4.1.2. Синтез Замидофосфитов бОдиметокситритилаллилоксикарбонилметилуридина и бОдиметокситритилбензилоксикарбонилметилуридина
4.1.3. Синтез олигонуклеотидов, содержащих
карбоксильную группу в 2положении углеводного фрагмента
4.2. Синтез модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих остатки оксоэтил0рибофуранозил урацила
4.2.1. Синтез Замидофосфита бОдиметокситритил2,3дибензоилоксипропилуридина
4.2.2. Синтез олигонуклеотидов, содержащих вицдиольную группу в 2положении углеводного фрагмента
4.3. Синтез модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих 5карбоксильную функцию в составе звена ненуклеотидной природы
4.3.1. Синтез метилхлортритилоксикарбонилпропилцианэтилЛ,Лдиизопропиламидофосфита
4.3.2. Синтез олигонуклеотидов, содержащих бконцевую карбоксильную группу
4.4. Изучение реакционной способности активных электрофильных группировок модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов и термической устойчивости модифицированных ДНКдуплексов
4.5. Синтез конъюгатов олигонуклеотидов, содержащих бконцевую карбоксильную группу, с нуклеофильными агентами
5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
6. ВЫВОДЫ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
В работе использованы символы и сокращения структурных компонентов нуклеиновых кислот и их производных в соответствии с рекомендациями Комиссии по номенклатуре Международного Союза чистой и прикладной химии I и Международного Союза биохимиков I, а также следующие обозначения
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
офВЭЖХ обращеннофазовая высокоэффективная жидкостная хроматография
ДМСО диметилсульфоксид
ДМФА диметилформамид
ПААГ полиакриламидный гель
ТГФ тетрагидрофуран
ТСХ тонкослойная хроматография
ЯМР ядерный магнитный резонанс
i азоизобутиронитрил
Ас ацетил
аллил
2третбугилимино2диэтиламино1,3диметилпергидро1,3,2диазафосфорин Вп бензил я бутил реябутил бензоил
гексанитратоцеррат аммония
стекло с определенным размером пор
.камфорсульфокислота
1,4диазабицикло2.2.2окган
дибензилиденацетон
1,8диазабицикло5.4.0ундецен
дициклогексилкарбодиимид
диметиламинопропил3этилкарбодиимид
I .диизопропилэтиламин
ОМАР 4,4диметиламинопиридин
4,4диметокситритил
2,4динитрофенилсульфенил дитиотреитол
гексафторфосфат 0бензотриазол1илЛ,Л.ЛЛтетраметилурония НОВТ гидроксибензотриазол i изобутирил i изопропил
диизопропиламид лития
i ixi iIii ii
2Лморфолиноэтансульфоновая кислота
мезитиленсульфонил
монометокситритил
оксид Vметилморфолина
дихромат пиридиния
пивалоилоксиметил
лтолуолсульфонат пиридиния
полистирол
Ру пиридин
фторид тетрабутиламмония
II2 ЗдихлорЗ.Зтетраизопропилдисилоксан тетраметилгуанидин триметилсилил лтолуолсульфонил
2. ВВЕДЕНИЕ
Химический синтез модифицированных олигонуклеотидов представляет собой наиболее интересную и сложную область исследований в органической химии нуклеиновых кислот НК. Модифицированные фрагменты НК могут использоваться как для решения разнообразных задач молекулярной биологии, так и при создании эффективных диагностических и терапевтических препаратов для лечения различных вирусных и наследственных заболеваний.
В этой связи важным является синтез олигонуклеотидных производных, обладающих рядом определенных химических, физикохимических и биологических свойств, необходимых для успешного использования полученных соединений и, далее, выявление взаимосвязи между их свойствами и строением. Для направленного изменения свойств НКфрагментов необходима разработка методов, использование которых позволяет трансформировать структуру нуклеиновых кислот с помощью замен мономерных звеньев или их фрагментов различными аналогами. Кроме того, к олигонуклеотидам можно ковалентно присоединять различные реакционноспособные или репортерные группировки, интеркаляторы, биологически активные пептиды и ферменты. В связи с этим актуальной задачей становится получение одно или двутяжевых молекул ДНК, имеющих в своем составе группировки, реакционная способность которых отличалась бы от реакционной способности функциональных групп немодифицированных ДНК. Именно введение новых реакционных центров в состав олигонуклеотидной цепи позволяет успешно осуществлять синтез различных гибридных молекул.
Целью настоящего исследования является разработка эффективных методов синтеза олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих в своем составе альдегидную или карбоксильную группу, и изучение химических свойств полученных соединений. Важной частью настоящей работы также является получение конъюгатов с различными нуклеофильными агентами на основе модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов данного типа.
Основными этапами работы были получение модифицированных мономерных компонентов такого строения, которое предопределяло возможность их использования в синтезе олигонуклеотидов по амидофосфитной схеме, подбор оптимальных условий для встраивания модифицированных звеньев в
олигонуклеотидную цепь, и изучение взаимодействия полученных олигомеров с различными соединениями с целью получения широкого набора конъюгатов.
В представленной работе предложены новые эффективные методы синтеза ранее неописанных олигодезоксирибонуклеотидов
1. Олигомеров, содержащих включения карбоксиметиладенозина или карбоксиметилуридина
2. Олигомеров, содержащих включения 2оксоэтилуридина
3. Олигомеров, содержащих на 5конце остаток 4гидроксивалериановой кислоты.
Введение


Именно введение новых реакционных центров в состав олигонуклеотидной цепи позволяет успешно осуществлять синтез различных гибридных молекул. На сегодняшний день существует большое число методов синтеза олигонуклеотидов, содержащих нуклеофильные группировки амино или тиогруппы 2, реагенты для введения которых в большинстве случаев коммерчески доступны. В то же время, получение олигонуклеотидов, содержащих реакционноспособные электрофильные группы карбоксильную или альдегидную представляется достаточно сложной задачей. Поэтому количество литературных данных по этой тематике весьма ограничено. Часть работ по синтезу 5карбоксилили альдегидсодержащих олигонуклеотидов была кратко рассмотрена в обзоре 2, посвященном более широкой теме синтезу различных производных фрагментов нуклеиновых кислот. Несмотря на это, необходимым представляется полный анализ и систематизация существующих работ, что, очевидно, будет способствовать дальнейшему развитию методов синтеза олигонуклеотидов данного типа. ДНК, в том числе по 5 либо Зконцам. Данный признак и был выбран в качестве основного при рассмотрении методов синтеза модифицированных олигонуклеотидов. Нами кратко описаны эксперименты, подтверждающие реакционную способность введенных электрофильных группировок, и методы получения олигонуклеотидных конъюгатов. В разделе 4. ДНКдуплексов. Во всех обсуждаемых работах олигонуклеотиды были синтезированы автоматическим тведофазным амидофосфитным методом по стандартному регламенту 2,3. Мы не рассматриваем методы получения олигонуклеотидов, содержащих диальдегидную группировку, поскольку именно этой теме посвящен обзор 4. Также за рамками обзора остались подтверждение строения промежуточных и целевых соединений, так как в абсолютном большинстве работ осуществлен корректный анализ с использованием современных физикохимических методов ЯМРспектроскопии и массспектрометрии, и методы выделения модифицированных олигонуклеотидов обращеннофазовая, ионообменная ВЭЖХ, гельэлектрофорез в ПААГ, если они стандартны. Для введения карбоксильной группировки на 5конец олигонуклеотида обычно используют модифицированное звено ненуклеозидной природы, которое присоединяют к растущей олигонуклеотидной цепи на последней стадии автоматического синтеза. При этом желательно, чтобы карбоксильная функция в процессе твердофазного синтеза была защищена, для чего ее превращают в сложный эфир. В работе 5 описан метод получения карбоксилсодержащих олигонуклеотидов с использованием амидофосфитного производного метилового эфира гидроксидодекановой кислоты 3 Схема 1. Присоединение амидофосфита 3 к олигомерной цепи осуществляли в соответствии со стандартным регламентом автоматического олигонуклеотидного синтеза. Гидролиз метилового эфира проводили до аммиачной обработки олигонуклеотида, поскольку при действии концентрированного водного раствора аммиака на сложный эфир происходит образование амида. Реакционную способность введенной алифатической карбоксильной группы подтверждали взаимодействием с аминами в присутствии диметиламинопропил3этилкарбодиимида 5 мМ раствор аминокомпонента, 4. Авторы отмечают, что при конденсации с нуклеофилами в этих условиях также происходит образование Лацилмочевины. Попытки избежать образования данного продукта за счет увеличения концентрации амина до 0 0 мМ или до 5. Авторы предполагают, что это происходит изза недостаточной концентрации свободной аминогруппы при таких значениях . Проблему удалось решить путем добавления в реакционную смесь имидазола, который взаимодействует с Оацилмочевиной с образованием активного промежуточного соединения имидазолида кислоты, затем реагирующего с амином. Более быстрое образование имидазолида предотвращает протекание перегруппировки Оацил в Лацилмочевину. Таким образом 5 были получены конъюгаты 5карбоксилсодержащего олигонуклеотида с аминами с количественным выходом. В работе 6 описан метод получения модифицированных олигонуклеотидов, содержащих на 5конце сложноэфирные группы 7 а, Ь Схема 2, постсинтетической обработкой которых 0.