ДНК-дуплексы с серосодержащими и иодацетамидными группами в сахарофосфатном остове как реагенты для ковалентного связывания с НК-узнающими белками

• Автор: Борисова, Оксана Анатольевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 117 с. : ил

Содержание

Условные сокращения

Введение.
I. Серосодержащие НК. Синтез, химическое поведение в супрамолекулярных комплексах биополимеров, биологические свойства.

литературный обзор.

1.1. Серосодержащие аналоги межнуклеотидной фосфодиэфирной

1.1.1. Химическое лигирование как метод введения Р8СН и РСН2С0Ь1Н5 связей в сахарофосфатный остов

олигонуклеотидов

1.1.2. Химическое лигирование как метод зондирования нуклеотидных последовательностей в одно и двуспиральных
ДНКмишенях

1.1.3. Химические и биологические свойства олигонуклеотидов,

содержащих мсжнуклсотидныс тиофосфатныс группы.
1.2. Нуклеиновые кислоты, содержащие дисульфидные мостики.
1.2.1. Введение дисульфидных связей в заданные участки
односпиральных ДНК.
1.2.2. Дисульфидные сшивки между концевыми звеньями двух и трехспиральных ДНК
1.2.3. ДНКдунлексы с ковалентно связанными цепями. Дисульфидные
связи между внутренними участками двойной спирали
1.2.4. Внутримолекулярные дисульфидные мостики в молекулах РНК.
Зондирование третичной структуры и динамики конформационных
перестроек.
1.2.5. Сравнительный анализ матричнозависимых и внедуплексных реакций, в которых принимают участие серосодержащие
олигонуклеотиды
1.3. Дисульфидные сшивки между белками и нуклеиновыми кислотами.
II. ДНКдуплексы с серосодержащими и иодацетамидными группами
в сахарофосфатном остове как реагенты для ковалентного связывания с
НКузнающими белками. Обсуждение результатов
.1. Характеристика белкамишени
П.2. Дизайн ДНКдуплексов и выбор участков модификации.
.3. Изучение термостабильности шпилечных дуплексов.
.4. Синтез и свойства ДНКдуплсксов с тризамещенными тиопирофосфатными межнуклеотидными группами, содержащими мостиковый кислород.
.4.1. Получение этиловых эфиров тиофосфатов
ол игонукл еотидов.
.4.2. Сравнительная характеристика серо и кислородсодержащих тризамешнных пирофосфатных межнуклеотидных связей в шпилечных дуплексах
получение и свойства.
.4.3. Связывание ДНКдунлексов, содержащих ТЗТП группу,
с фактором транскрипции .
П.5. Жесткие и мягкие нуклеофилы и электрофилы. Химический запрет
на получение ДНКдуплексов с ТЗТПгруппами с мостиковой серой
II.6. Модифицированные ДНКдуплексы как потенциальные реагенты
для ковалентного связывания с цистеинсодержащнми белками.
И.6.1. ДНК, содержащие дифосфорилдисульфидную группировку
вместо одной из фосфодиэфирных связей.
П.6.1.1. Синтез олигонуклеотидов с связью в заданном положении
углеводофосфатного остова.
И.6.1.2. Свойства олигонуклеотидов, содержащих
в углеводофосфатном шпилечном остове
II.6.1.3. Комплексообразование ДНКдуплексов, содержащих
связь, с фактором транскрипции .
.6.2. ДНКдуилсксы содержащие единичные монофосфорилдисульфидные
связи .
.6.2.1. Синтез олигонуклеотидов, содержащих связь в заданном
положении углеводофосфатного остова.
.6.2.2. Свойства олигонуклеотидов, содержащих связь в
углеводофосфатном остове
.6.2.3. Нековалентное связывание ДНКдуплексов, содержащих
связь, с фактором транскрипции
.6.2.4. Ковалентное связывание ДНКдуплексов, содержащих или связи, с функциональноважными белками
.6.3. ДНКдуплексы, содержащие иодацетамидную группировку в
2положении сахарного остатка
П.6.3.1. Получение олигонуклеотидов с единичной иодацетамидной группой
в 2положении рибозного кольца
И.6.3.2. Свойства олигонуклеотидов, содержащих иодацетамидную фуппировку
в 2положении углеводного остова.
П.6.3.3. Изучение термической устойчивости ДНКдуплексов, содержащих
2амино2дезоксирибоуридиновыс звенья.
Н.6.3.4. Комплексообразованиеиодацетамидных производных ДНКдуплексов
с фактором транскрипции ОТкВ
II.6.3.5. Ковалентное связывание иодацетамидных производных
ДНКдуплексов с фактором транскрипции кВ.
Экспериментальная часть
Выводы.
Список литературы


Модифицированные олигонуклеотиды и их двуспиральные комплексы широко используются в качестве прецизионных инструментов для исследования тонких биологических процессов, связанных с реализацией генетической информации, а также в биотехнологической практике. Они позволяют изучать структурнофункциональные аспекты белковонуклеиновых взаимодействий, природу контактов НК белок, конформационную динамику НК и др. С помошыо синтетических подходов можно придавать модифицированным олигонуклеотидам такие полезные свойства, как устойчивость к нуклеазной деградации, способность необратимо связываться с регуляторными белками и ферментами, проникать через клеточную мембрану, специфически расщеплять НК и др. Известно, что аналоги НК, в которых вместо мостикового кислорода в сахарофосфатном остове находится атом серы эти атомы близки по геометрическим размерам и распределению зарядов, нашли широкое применение при зондировании участков связывания белков, ферментов и металлов с НК. В результате выяснены важные закономерности процессов расщепления фосфодиэфирных связей, катализируемых ферментами и рибозимами ,. В последние годы устойчиво растет интерес исследователей к дисульфидсодержащим аналогам НК, поскольку межцепочечные дисульфидные сшивки дают возможность зондировать третичную структуру и контролировать конформационную свободу биополимеров, существенно не меняя их нативную конформацию ,. Это особенно важно при изучении ДНКсвязывающих белков, для функционирования которых необходимо разделение комплементарных цепей. В настоящем обзоре рассмотрены различные типы направляемых вторичной третичной структурой химических реакций с участием серосодержащих олигонуклеотидов, а также методы введения серосодержащих группировок в заданные участки биополимеров сахарофосфатный остов ДНК, между гетероциклическими основаниями одной цепи или между комплементарными цепями ДНК, между сближенными в третичной структуре фрагментами РНК, а также между олигонуклеотидами и белковыми молекулами. Особое внимание уделено специфическим химическим свойствам серосодержащих функциональных групп и новым чертам химического поведения, обусловленным эффектами близкодействия. Параллельно оценена возможность протекания некоторых типов реакций вне супрамолекулярных систем. Охарактеризованы особенности вторичной структуры комплексов НК НК и НК белок, которые использовались для проведения химического лигирования и ковалентного связывания с белком, а также химические свойства модифицированных соединений и перспективы их использования или использования предложенных для их получения подходов в молекулярно биологических исследованиях. В обзор не включены многочисленные работы по синтезу широко используемых в аптисмысловой биотехнологии олигонуклеотидов с межнуклеотидными тиофосфатными группами, а также исследования фотохимических радикальных процессов с участием серосодержащих производных, поскольку химизм таких превращений до сих пор неясен. Характерной особенностью реакций внутри двойной спирали ДНК является пространственная сближенность реагирующих групп и их определенная ориентация за счет сил, стабилизирующих спираль. Ускорение реакции в 3 раз по сравнению с аналогичными процессами в растворе не может быть объяснено простым концентрационным эффектом важную роль здесь играют также конформационные факторы. Однако при условии существования стабильного и продуктивного комплекса, на первый план выходит поиск наиболее эффективных методов активации реагирующих групп. В настоящее время широко используются две техники ХЛ. В основе первой лежит применение водорастворимых химических реагентов карбодиимиды, ВгСЫ, способных активировать фосфатную группу или ее аналоги непосредственно в составе сформированной двойной спирали . Во втором случае используются преактивированные олигонуклеотидные производные азолиды, эфиры и др. Первый пример использования тиофосфорилированного олигонуклеотида в реакции ХЛ представлен в работе Ошсвского . Для повышения эффективности образования новой межнуклеотидной связи в реакциях, индуцированных водорастворимым карбодиимидом, он заменил 5фосфатпую группу в олигонуклеотиде на более нуклеофильную 5тиофосфатную .