Подходы к повышению эффективности гетерофазного анализа биомолекулярных маркеров

• Автор: Дмитриенко, Елена Владимировна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 191 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Список сокращений
1. Введение
2. БИОСЕНСОРНЫЕ УСТРОЙСТВА: ПРИРОДНЫЕ И СИНТЕТИЧЕСКИЕ 9 СИСТЕМЫ РАСПОЗНАВАНИЯ
{обзор литературы)
2.1 Биосенсоры
2.1.1 Детекция нуклеиновых кислот
2.1.1.1 Оптические методы детекции
2.1.1.1.1 Флуоресцентная детекция
2.1.1.1.2 Спектроскопия усиленного поверхностью комбинационного рассеяния 16 (КР)
2.1.1.1.3 Поверхностный плазменный резонанс
2.1.1.1.4 Хемилюминесцентная детекция
2.1.1.1.5 Биолюминесцентная детекция
2.1.1.1.6 Колориметрическая детекция
2.1.1.2 Микромеханические (пьезоэлектрические) устройства
2.1.1.2.1 Кварцевые кристаллические микровесы
2.1.1.2.2 Микровесы на основе кантилевера для атомно-силовой микроскопии 26 (ACM)
2.1.1.3 Электрохимические ДНК-сенсоры
2.1.1.3.1 Электрохимические label-free биосенсоры
2.1.1.3.1.1 Методы детекции, основанные на прямом переносе электронов в ДНК
2.1.1.3.1.2 Методы, основанные на изменениях проводящих свойств поверхности
2.1.1.3.1.3 Использование медиаторов в электрохимических методах детекции 33 ДНК
2.1.1.3.2 Электрохимический анализ с использованием репортерных групп
2.1.1.3.2.1 Электрохимический анализ ДНК, с использованием интеркаляторов и
малобороздочных лигандов
2.1.1.3.2.2 Использование Ox/Red репортерных групп для амплификации сигнала в
ДНК-сенсорах с электрохимическим принципом детекции
2.2 Получение и применение биотехнологически значимых молекулярно 39 импринпшрованных полимеров
2.2.1 Получение МИПов
2.2.2 Классификация методов молекулярного импринтинга
2.2.2.1 Нековалентный импринтинг
2.2.2.2 Ковалентный импринтинг
2.2.2.3 Полуковалентный импринтинг
2.2.3 МИПы на основе готовых полимеров
2.2.3.1 Полимерные мембраны и МИПы на основе капрона
2.2.3.2 МИПы на основе биополимеров
2.2.4 Импринтинг биологических объектов
2.2.4.1 Трудности импринтинга биомолекул
2.2.4.2 Трехмерный импринтинг биомолекул
2.2.4.2.1 Молекулярно импринтированные полимеры на основе гидрогелей
2.2.4.2.2 Импринтинг с использованием композитных материалов
2.2.4.2.3 Использование координирующих катионов металлов в процессе 65 импринтинга
2.2.4.2.4 Подход антигенной детерминанты
2.2.4.3 Двумерный импринтинг (импринтинг на поверхности)
2.2.4.4 Импринтинг биологических объектов (вирусы, бактерии, клетки)

2.2.5 Применение МИПов
2.2.5.1 Синтетические антитела in vivo
2.3 Заключение
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1 Исходные материалы
3.2 Методики измерений и экспериментов
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1 Иммобилизация нуклеиновых кислот на твердотельные подложки
4.1.1 Ковалентная иммобилизация аминосодержащих олигонуклеотидов на
различные гетерофазные поверхности
4.1.1.1 Эффективность иммобилизации
4.1.1.2 Гибридизационный анализ с использованием микрокансшъных кремниевых 111 матриц (МКМ)
4.1.1.3 Выявление биомолекул с помощью эллипсометрического сканирования
4.1.2 Фотогшмобилизация олигонуклеотидных зондов на капроне
4.1.2.1 Анализ факторов, определяющих эффективность иммобилизации 118 олигонуклеотидных зондов на капроновой мембране
4.1.2.2 Исследование эффективности выявления специфических 121 последовательностей ДНК с помощью УФ-иммобптзованных зондов
4.1.2.3 Влияние аминогрупп капрона на эффективность фотоиммобилизации 125 олигонуклеотидов
4.1.2.4 Анализ факторов, влияющих на светочувствительность капрона
4.2 Исследование эффективности выявления специфической 131 последовательности НК
4.2.1 Изотермическая амтификация сигнала при анализе ДНК методом 132 минисеквенирования
4.2.1.1 Описание модельных систем
4.2.1.1.1 Гомофазные модельные системы
4.2.1.1.2 Гетерофазные модельные системы
4.2.1.2 Изотермическая амтификация сигнала гибридизационного анализа в 136 гомофазном варианте
4.2.1.2.1 Влияние температуры реакции на эффективность ферментативного 136 мечения зонда
4.2.1.2.2 Анализ кинетической схемы изотермической амплификации сигнала
4.2.1.2.3 Анализ сиквенс-специфичности превращет4я зонда в реакции 143 минисеквенирования ДНК
4.2.1.3 Изотермическая амтификация сигнала в гетерофазном варианте
4.3 Разработка прототипов тест-систем для гетерофазного анализа НК
4.3.1. ДНК-чипы для выявления и генотипирования вируса гепатита С (ВГС)
4.3.1.1 Выбор и дизайн олигонуклеотидных зондов
4.3.1.2 Этапы проверки, отбора зондов и пробоподготовки анализируемой ДНК
4.3.1.3 Конструирование «стрипа»
4.3.2 Анализ значимых нуклеотидных замен в составе полиморфных участков ДНК
4.4 Молекулярно импринтированные полимеры
4.4.1 Выбор растворителя
4.4.2 Структура полимерных матриксов
4.4.3 Получение МИПов
4.5 Заключение
5. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ACM - атомно-силовая микроскопия
БСА - бычий сывороточный альбумин
ВГС - вирус гепатита С
ВИЧ - вирус иммунодефицита человека
ВИТ - вирус некроза табака
ВТМ - вирус табачной мозаики
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ГКР - гигантское комбинационное рассеяние
ДМАП - диметиламинопиридин
ДМЭГ - мелкодисперсный полимер на основе метакрилата
ДМСО - диметилсульфоксид
ДМФА - диметилформамид
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДТАБ - додецилтриметиламмония бромид
ИОП - интегральная оптическая плотность
КД - круговой дихроизм
ККМ (QCM) - кварцевые кристаллические микровесы
KP - комбинационное рассеяние
МИП - молекулярно импринтированный полимер
МКМ - микроканальная кремниевая матрица
НИИ - неимпринтированный полимер
НК - нуклеиновая кислота
5-НТО - 5'-нетранслируемая область
ПААТ - полиакриламидный гель
ПАВ - поверхностно активное вещество
ПВП - поливинилпирролидон
ПЗС - прибор с зарядовой связью
ИНК - полинуклеотидкиназа
ПИР - поверхностный плазмонный резонанс
ПСА - персульфат аммония
ПЭГ - полиэтиленгликоль
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РНКаза А - рибонуклеаза А
СЭМ - сканирующая электронная микроскопия
ТГФ - тетрагидрофуран
Трис - трисоксиметиламинометан
ТФП - 2,2,3,3-тетрафторпропанол
ТФЭ - 2,2,2-трифторэтанол
ТЭА - триэтиламин
УФ —ультрафиолет
XJI - хемилюминесценция
ЧРВ - риновирус человека
ЧСА - сывороточный альбумин человека
ЦТАБ - цетилтриметиламмония бромид
ЭИС - электрохимическая импедансная спектроскопия
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
обуславливает простоту и высокую чувствительность обнаружения аналита (рис. 2.23). Так, комплексные соединения кобальта, например, Со(рЬеп)з3+ используют как электрохимически активные индикаторы гибридизации. Со(рЬеп)з3+ связывается с НК-дуплексом в малой бороздке спирали и концентрируется на поверхности электрода, где может быть окислен и обнаружен вольтамперометрически. При использовании данного подхода предел обнаружения кДНК ВИЧ составил 2.7 х Ю'11 М [79].
Рис. 2.23. Электрохимические ДНК-сенсоры, разработанные на основе окислительновосстановительно активных индикаторов гибридизации с использованием малобороздочных лигандов (А) или интеркаляторов (Б).
2.1.1.3.2.2 Использование Ox/Red репортерных групп для амплификации сигнала в ДНК-сенсорах с электрохимическим принципом детекции
Как в оптических и микромеханических методах детекции, в электрохимическом анализе популярны методы с использованием репортерных групп, в качестве которых могут выступать окислительно-восстановительно активные соединения, например, ферроцен (и его производные) [93]. Благодаря низкому окислительно-восстановительному потенциалу, а также стабильности окисленных и восстановленных форм, ферроцен часто используется в качестве репортерной группы при анализе ДНК. Чаще всего ферроцен вводят в систему электрохимической детекции при ферментативном удлинении последовательности ДНК в составе модифицированного нуклеотидтрифосфата или олигонуклеотида. В такой системе ДНК-процессирующие ферменты могут не только участвовать в процессе формирования сигнального продукта, но и обеспечивать дополнительную селективность анализа. Например, в работе [77] предложена стратегия выявления точечных мутаций, основанная на использовании ДНК-лигазы. Формирование комплекса между олигонуклеотидным зондом, иммобилизованным на поверхности золотого электрода, ДНК-мишенью и сигнальным зондом, несущем ферроценовую метку, с последующим лигированием ника и термической денатурацией образуемого дуплекса, приводит к формированию шпилечной структуры, благодаря чему ферроценовая метка оказывается в непосредственной близости к электродной поверхности, где происходит ее окисление (рис. 2.24). Чувствительность выявления анализируемой ДНК методом инверсионной вольтамперометрии составила 10'12 М.