Разработка новых липидных зондов на основе производных дипиррометена для исследования мембран

• Автор: Болдырев, Иван Александрович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 118 с. : ил.

Известно, что механические взаимодействия бислоя липидного окружения с молекулой белка могут быть опосредованы изменением напряжения изгиба мембраны, стремлением бислоя и белка уменьшить гидрофобное несоответствие разницу между протяженностью гидрофобного участка белка и толщиной гидрофобной области бислоя, а также изменением профиля латерального давления. Для каждого из перечисленных механизмов известны примеры, однако их сложно формализовать. Например, может быть установлено, что изменение конформации белка было вызвано изменением профиля латерального давления, но неизвестно каким был этот профиль до и после изменения конформации. Инструментом для изучения свойств мембраны на разном расстоянии от поверхности бислоя может быть набор флуоресцентных липидных зондов, у которых флуорофор находится на разной глубине внутри мембраны. Латеральное давление внутри бислоя определяется подвижностью метиленовых групп жирнокислотных цепей. Мерой этой подвижности выступает анизотропия флуоресценции метки. Их применение позволит составить более точное представление о строении различных доменов мембран и свойствах мембранных фаз. При изучении влияния свойств мембран на функционирование мембранных белков новый набор зондов позволит получить качественно новую информацию о состоянии системы. Например, станет возможным следить за изменением профиля латерального давления одновременно с наблюдением за активностью белка. Задачей настоящего исследования была разработка набора флуоресцентных липидных зондов для изучения свойств биологических и модельных мембран на разном расстоянии от поверхности бислоя. С этой целью необходимо было подобрать флуорофор, синтезировать набор зондов на его основе, исследовать спектральные характеристики новых зондов и их поведение в мембране. Кроме того, важно было показать применимость нового набора зондов для решения поставленных задач. Обзор литературы. Возросшая в последние годы популярность флуоресцентных методов исследования мембран объясняется не только их чувствительностью, но и резко расширившейся методологией появлением большого выбора флуоресцентных зондов, возможностью визуально следить за процессами i viv и т. В сложных многокомпонентных мембранах оказалось возможным с помощью флуоресцентной или конфокальной микроскопии сначала установить латеральное распределение зонда, а затем с помощью стационарной или наносекундной флуориметрии исследовать структуру разных мембранных доменов. Большую роль сыграла и относительная доступность аппаратуры для флуоресцентных исследований. С другой стороны, достижения молекулярной динамики и статистической термодинамики позволили получить новые сведения о строении мембран. Хорошо известно, что структура мембран влияет на функционирование мембранных белков 1. Похожая зависимость активности белка от состава мембраны показана для бактериальной транслоказы весУЕС 9, цитохрома РСС , , родопсина , митохондриального переносчика адениннуклеотида , осмочувствильного АВСпереиосчика ОриА , , убихинонцитохром Средуктазы, 2АТФазы и НаМз2АТФазы из А. ЫсИатп и НАгГФазы . Было показано также, что проводимость кальцийзависимого калиевого канала , механочувствительных каналов , каналобразующих пептидов аламетицина и грамицидина также зависит от состава мембраны. Активность ряда ферментов может ингибироваться в присутствии небислойных липидов, как это показано для фосфолипазы С 4, и диацил глицеринкиназы . Присутствие некоторых липидов может оказывать влияние на фолдинг ряда белков, как. Однако пока непонятно, через изменение каких именно параметров мембраны осуществляется их функционирование например, что приводит к изменению конформации интегрального белка или влияет на связывание периферийного белка с мембраной. Возможно, такая ситуация сложилась изза недостаточной разработанности экспериментальных методов изучения взаимодействий липидов и белков. Так, изменяя липидный состав мембраны можно наблюдать за изменением активности иили конформации интегрального белка. Например, можно определить открыт или закрыт механочувствительный ионный канал . Однако, пока не удается выяснить точно, изменение каких свойств мембраны приводит к открытию этого канала. Т.е.