Структурно-функциональное исследование теломеразы дрожжей Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Петров, Андрей Владимирович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 160 с.

Содержание Стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Введение.

Глава I. Обзор литературы. Структура теломеразного комплекса

1. Структура и функции теломеразных РНК.

1.1. Первичная структура теломеразных РНК

1.2. Матричный район теломеразных РНК

1.3. Роль элементов вторичной структуры РНК

в функционировании теломеразы.

2. Теломеразные обратные транскриптазы .,

2.1. Структурные особенности теломеразных обратных транскриитаз

2.2. Регуляция экспрессии ТЕТ позвоночных .,
3. Белки, ассоциированные с теломеразным комплексом.
Глава II. Результаты и их обсуждение
1. Выделение н очистка теломеразного комплекса 5. сегечтае.
1.1. Ультрацентрифугирования в градиенте плотности глицерина
1.2. Ионообменная хромтография.
2. Функциональные свойства теломеразного комплекса 5. сегеутае.
2.1. Процессивность
2.2. Нуклеазная активность.
2.3. ДНКзависимаяДНКполимеризующая активность.
3. Структурное исследование теломеразного РНП.
3.1. Метод фотоаффшшого химического сшивания.
3.2. Введение аффинных эпитопов в первичную структу ру Екр
3.3. Идентификация некоторых компонентов теломеразного
комплекса .
Глава III. Материалы и методы
1. Реактивы
2. Биопрепараты
3. Штаммы
3.1. ii i.
3.2. vii.
4. Буферы, наиболее часто используемые в работе
5. Выделение суммарного дрожжевого экстракта.
6. Фракционирование экстракта в градиенте
плотности глицерина .
7. Анионообменная хроматография на агарозе.
8. РНКблотгибридизация
9. Определение теломеразной активности
. Детекция нуклеазной активности
. Делегирование гена теломеразной РНК в составе хромосомы.
.1. Трансформация клеток ii i
.2. Выделение суммарной ДНК дрожжей
.3. Создание конструкций для делении 1
.3.1. Получение фрагмента ДНК, соответствующего гену
1 и 5iii ающего района
.3.2. Получение конструкции .
.3.2. Получение конструкции
.4. Трансформация клеток vii
.5. Анализ полученных трансформантов.
.5.1. ПЦР.
.5.2. Выделение суммарной РНК дрожжей
. Определение первичной структуры олигонуклеотидов
методом МаксамаГилберта.
. Детекция ДНКзависимойДНКполимеризующсй активности.
. Фотоаффинное химическое сшивание.
. Введение аффинных эпитонов в первичную структуру Ер.
.1. Создание конструкций для введения аффинных эпитопов.
.1.1. Получение фрагмента ДИК, соответствующего 3
району гена Е8Т2 и прилегающей к нему области.
.1.2. Получеие конструкции МЕР1
.1.3. Получение конструкции МЕ.
.1.4. Определение первичной структуры ДНК по Сэпгеру.
.1.5. Полу чение конструкций рМЕМ1 и рМЕМ4.
.1.6. Получение конструкции рМЕХЗ
.2. Трансформация клеток дрожжей фрагментами ДНК
и анализ трансформантов
.2.1. ПЦР
.2.2. Иммуноблотинг
. Иммунное осаждение теломеразиого комплекса.
. Идентификация компонентов теломеразиого комплекса с помощью МАЬ и ЕвЬмассспектрометрии.
Выводы.
Список ЛИТЕРАТУРЫ


Вполне возможно, что общими для всех организмов и определяющими основные функции теломеразы являются некоторые элементы третичной структуры. Однако к настоящему времени накоплено слишком мало данных, чтобы создать модель пространственной организации теломеразных РНК. Вместе с тем, на основании имеющихся результатов по мутациям, делениям, сшивкам можно уже сейчас выявить некоторые функционально важные районы теломеразных РНК. Первичная структура теломеразных РНК. Как уже было отмечено выше, первичные структуры теломеразных РНК довольно разнообразны. Различия проявляются не только в нуклеотидной последовательности, но и в длине РНК, которая возрастает от низших организмов к высшим. Гак, у жгутиковых длина РНК варьирует от 7 до 9 нуклеотидных остатков , у человека и мыши она составляет 0 , , а у дрожжей достигает нуклеотидного остатка табл. Функциональная значимость различных доменов теломеразной РНК дрожжей изучена пока недостаточно, поэтому нельзя утверждать определенно, почему дрожжевая теломеразная РНК настолько отличается от других молекул. С другой стороны, необычно длинные РНК мшут быть особенностью дрожжей. Так, например, малая ядерная РНК 2 5. РНК млекопитающих . Интересно также, что в подавляющем большинстве теломеразных РНК матричная область располагается в пределах примерно нуклеотидных остатков от 5коица и лишь в дрожжах она находится на расстоянии 0 нуклеотидных остатков. Нуклеотидные последовательности теломеразных РНК сильно отличаются уже в пределах одного рода. РНК i и , гомологичны лишь на , тогда как нуклеотидные последовательности генов рибосомных РНК из этих организмов идентичны на . Ген теломеразной РНК человека был использован в качестве зонда при поиске аналогичного гена у мыши . Оказалось, что совпадение по первичной структуре у этих двух генов составило всего лишь , что значительно меньше, чем для других малых РНК из этих организмов . Матричный район теломеразных РНК. Первичные структуры матричных районов теломеразных РНК различных организмов и, соответственно, последовательности самих тсломерных повторов также не являются высококонсервативными табл. Любые изменения в матричной последовательности теломеразной РНК вызывают адекватные изменения в первичной структгрс теломер i viv , , , . Следует отметить, что подобные мутации либо не влияют на активность теломеразы, либо приводят к укорочению теломер, преждевременному старению и гибели клетки. Таблица 1. Матричная область теломеразных РНК и синтезируемый теломерный повтор. Организм Длина РНК. Наиболее хорошо изученной является матричная область РНК i. Еще на самых ранних этапах изучения этой РНК 6 было показано, что матрицей для синтеза теломер служат 9 нуклеотидных остатков, занимающих позиции от до табл. Можно условно разделить матричный район на два функциональных субдомена, необходимые для связывания и удлинения праймера , . Было показано, что Зконцевые нуклеотиды матрицы 3ЛАС5 образуют комплементарные взаимодействия с З1концом праймера. Остальные 6 нуклеотидов положения служат собственно матрицей в реакции обратной транскрипции. Помимо изменения последовательности теломер мутации в матричной области теломеразнон РНК вызывают изменения функциональных свойств комплекса вцелом. Например, мутации в положениях и вызывают преждевременную диссоциацию праймера после копирования нуклеотидного остатка. Точечные замены матричных нуклеотидов могут приводить к изменению точности синтеза теломерного повтора. Б частности, вставка одного дополнительного остатка цитозина в матричную область РНК приводит к тому, что фермент начинает заикаться, включая в теломерную ДНК от 1 до остатков как i vi , так и i viv . Кроме того, замена С на в положении приводит к ошибочному копированию соседних нуклеотидов и . С другой стороны полное изменение первичной структуры матричного района РНК не приводит к ошибочному включению нуклеотидов . Теломерный повтор у i не является регулярным. Несмотря на то, что теломеразная РНК представлена одним геном, теломерная ДНК состоит из случайной смеси 42 и 33 повторов в соотношении 7 к 3, соответственно .