Влияние ненуклеотидных вставок на субстратные и конформационные свойства ДНК-дуплексов

• Автор: Виноградова, Ольга Александровна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 160 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ Список сокращений 1. Введение

2. Принципы регулирования структуры и функций олнгонуклеотндных ДНК 9 дуплексов в структурной ДНКнанотехнологии и гибридизационном анализе обзор литературы

2.1. Структурная ДНКнаиогехнологня. Принципы конструировании

нанообъектов на основе нативных и модифицированных молекул ДНК

2.1.1. Принципы формировании ДНКблоков

2.1.1.1. Разветвленные ДНКблоки на основе нативных олигонуклеотидов

2.1.1.2. ДНКблоки с использованием дополнительных конструктивных

элементов

2.1.2. Статические ДНКнаноструктуры

2.1.2.1. Дискретные ДНКобъекты

2.1.2.1.1. Двухмерные замкнутые ДНКструктуры

2.1.2.1.2. Трехмерные ДНКмногогранники
2.1.2.2. Периодические ДНКматрицы
2.1.2.2.1. ДНКрешетки
2.1.2.2.2. ДНКнанотрубки
2.1.2.3. ДНКоригами
2.1.3. Перспективы практического применения ДНКнаноконструкций
2.2. Гибридизацнонный анализ. Структура олнгонуклеотндных зондов как фактор, влияющий на селективность выявлении нуклеотидных полиморфизмов в ДНК
2.2.1. Проблемы селективности ДНКзависимых ферментов по отношению к некомплементарным парам в структуре нативного ДНКсубстрата
2.2.2. Возмущение структуры ДНКсубстрата как способ повышения селективности ферментативной реакции
2.2.2.1. Влияние структуры олигонуклеотидных зондов на селективность ферментативной реакции
2.2.2.2. Введение дополнительного ол иго нуклеотидного несоответствия в структуру ДНКсубстрата как способ повышения селективности
2.2.2.3. Модификации олигонуклеотидов, повышающие селективность превращения ДНКсубстратов под действием ДНКзависимых ферментов
2.2.2.3.1. Модификации гетероциклических оснований
2.2.2.3.2. Модификации углеводного остатка
2.2.2.3.3. Модификации межпуклеотидного фосфодиэфирного остатка
2.3. Заключение
3. Экспериментальная часть
3.1. Исходные материалы
3.2. Основные методы
4. Результаты и обсуждение
4.1. Конформационныс особенности ДНКдуплексов на основе мостиковых олигонуклеотидов
4.1.1. Теоретические аспекты анализа конформацнониых особенностей ДНК дуплексов методом задержки в геле
4.1.2. Влияние внутренних выпетливаннй на конформационныс особенности
модифицированных ДНКдуплсксов
4.1.2.1. Исследование электрофоретической подвижности модифицированных ДНКдуплексов
4.1.2.2. Количественная оценка величины изгиба модифицированных ДНК комплексов
4.1.2.3. Влияние дополнительных звеньев в матричной цени на конформациончые особенности модифицированных ДНКкомплексов
4.1.3. Влияние отрицательно заряженных фосфатных остатков на конформацнонные особенности ДНКлуплекса
4.1.4. Взаимосвязь между термической стабильностью комплексов с выпегливанинми и величиной изгиба их основной оси
4.2. Многокомпонентные ассоциаты на основе модифицированных ДНК дуплексов
4.2.1. Характеризация особенностей организации модифицированных ДНК конкатемеров методом гельэлектрофореза
4.2.2. Устойчивость нативных и модифицированных ДНКконкатемеров по 2 отношению к действию нуклсаз
4.2.3. Эффективность гибридизации конкатсмсрных ДНКкомплексов с 3 олнгонуклсотидомстоппсром
4.2.4. Исследование строения ДНКконкатемеров методом атомносиловой 5 микроскопии
4.3. Мостиковыс олигонуклеотиды в качестве компонентов субстратных 1 комплексов в реакциях ДНКзависимых ферментов
4.3.1. Точность удлинения Тац ДНКполимсразой нативного и мостиковых 3 олигонуклеотидов в присутствии ограниченного набора дсзокснрибонуклсозид5трнфосфатов
4.3.2. Влияние однонуклеотндных несоответствий в составе ДНКматрицы на 9 эффективность лигирования Т4 ДНКлигазой субстратных комплексов, содержащих нснуклсогндную вставку в структуре Ркомпонсн га
4.3.3. Определение кинетических параметров реакции превращения нативных 0 и модифицированных ДНКсубстратов с помощью Т4 ДНКлигазы
4.3.3.1. Кинетические параметры ферментативного превращения нативных и 1 модифицированных ДНКдуплексов под действием Т4 ДНКлигазы в стационарном режиме
4.3.3.2. Кинетические параметры ферментативного превращения нативных и 6 модифицированных ДНКдуплексов под действием Т4 ДНКлигазы в предстационарном режиме
4.3.3.2.1 Исследование лигирования нативных и модифицированных субстратных 6 ДНКкомплексов методом остановленной струи
4.3.3.2.2 Взаимодействие Т4 ДНКлигазы с дцДИК продуктом реакции 1 лигирования
4.3.3.2.3. Количественный анализ данных, полученных методом остановленной 2 струи
4.4. Мостиковые олигонуклеотиды в качестве высокоселсктивных зондов при 4 выявлении комплементарной последовательности в дцПЦРфрагменте
4.4.1. Влияние вторичной структуры ДНКматрицы на эффективность 5 гибридизационного анализа с участием мостиковых олигонуклеотидов
4.4.2. Статистическая фрагментация ДНК
4.4.2.1. Кислотнозависимая фрагментация ДНКпробы
4.4.2.2. Ферментативная фрагментация ДНК
4.4.3. Эффективность превращения Костиковых олигонуклеотидов на
совершенной фрагментированной ДНКмагрнце с помощью полимеразы
4.4.4. Эффективность превращения мостиковых олигонуклеотидов на
фрагментированной ДНКматрице, содержащей нуклеотидные несоответствия,
с помощью полимеразы
4.5. Заключение
5. Выводы
Список литературы


Авторы отмечают, что любой из полученных параллельных кроссоверов не обладает достаточной стабильностью, они диссоциируют или формируют мультимеры . Все представленные выше Xблоки по своей топологии являются крестообразными структурами с четырьмя расходящимися дцДНКспиразями. На основе X были сформированы пяти и шести разветвленные ДНКблоки X и X2 соответственно рис. На основе нативных олигонуклеотидов получены более сложноорганизованные паранемные кроссоверы РХ, в которых два параллельных ДНКдуплекса формируют кроссоверы в каждой возможной точке, т. ДНКцепей образует перехлест через целое число оборотов рис. ШЛб. Рис. Разветвленные ДНКблоки на основе нативных олигонуклеотидов. Получены блоки на основе большего количества параллельно расположенных дцЦНК, попарно соединенных двойными кроссоверами. Например, представлено построение тройных кроссоверов ТХ, образуемых в результате переплетения трех ДНКспиралей , а также кроссоверов из четырех X рис. ЕХ и двенадцати X дцДНК , . Кроме того, на основе ТХблока получен трехмерный ТХТблок рис. Схожие по формы с блоками, но более жесткие блоки от англ. ДНКфрагментами, каждый из которых представляет собой два параллельных ДНКдуплекса, соединенных точкой кроссовера. Показано формирование подобных трех, четырех, пятии шестиразветвлениых структур А, А, 5, 6 рис. Такие сложные блоки обладают структурной стабильностью и жесткостью в отличие от блоков, однако для их построения требуется большое количество олигонуклеотидов. Гак в формировании ЗА, 4А, 5А и 6А участвуют 3, 4, 5 и 6 олигонуклеотидов соответственно, в то время как для 3, 4, 5 и А необходима гибридизация 7, 9, и компонентов соответственно. В работах Мао С. Обычно при построении сложных ДИКобъсктов на основе разветвленных блоков в точку разветвления вводят одноцепочечные фрагменты для придания им дополнительной структурной подвижности рис. Длина одноцеиочечных участков может варьировать в зависимости от задач ДНКнаноконструирования. В основе принципов конструирования описанных выше мультиразветвленных ДНКблоков лежит ряд правил минимизация симметрии последовательностей отдельных олигонуклсотидных компонентов относительно точки разветвления проведение сборки ДНКблока при четко выполненном стехиометрическом соотношении олигонуклсотидных составляющих ,. Организация разветвленных ДНКблоков может быть связана с использованием дополнительных конструктивных элементов, например, белков или РНКфрагментов . НКфрагмснты, могут способствовать построению нелинейных блоков. ДНКблок табл. НКфрагменты в составе координационного комплекса с катионом металла табл. В настоящее время в литературе представлено большое разнообразие фосфорамидитиых сингонов органических молекул, применяемых в автоматическом синтезе олигонуклеотидов наряду с мономерами природных нуклеотидов. Среди них можно выделить как простые линкеры, соединяющие два нативных олигонуклеотидных фрагмента, так и более сложные разветвляющие модификации, соединяющие три и более нуклеотидные цепи табл. ДНКблоки на основе даже простых модификаций, соединяющих два ИКфрагмеита, перспективны для получения сложных объектов, поскольку могут приводить к изгибу основной оси дцДНК . Введение в один из олигонуклеотидных компонентов ДНКдуплекса модификации на основе остатка 1,3бис4гидроксифснилбензола 1 будет способствовать изгибу ДНКблока с предпочтительной ориентацией расходящихся дцДНКфрагментов под углом 0 . Кроме того использование модифицированных остатков будет способствовать приданию структуре комплексов на основе соответствующих НКнроизводных динамической подвижности, недостающей нативным аналогам. В случае необходимости получения олигонуклеотидного производного с парой свободных Зконцевых участков прибегают, например, к использованию твердофазного носителя с иммобилизованными через атом углерода двумя остатками р2гидроксиэтилфснилэтинилфенила 2 . Синтез модифицированных олигонуклеотидов с использованием специальных синтонов проводят по стандартному протоколу наращивают нуклеотидную цепь вплоть до позиции модификатора, после введения которого продолжают синтез одной или нескольких олигонуклеотидных фрагментов.